[发明专利]一种重组猪囊尾蚴期特异性抗原cC1的高效可溶性表达方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种重组猪囊尾蚴期特异性抗原cC1的高效可溶性表达方法。

技术背景

猪囊尾蚴期特异性抗原cC1(cysticercus common antigen 1)是以囊虫病患者、囊虫病病猪血清为探针从猪囊尾蚴cDNA文库中筛选的具有高度特异性的人、猪共同抗原，该蛋白基因序列具有4个膜联蛋白家族的保守序列，故将其归属于膜联蛋白家族，又命名膜联蛋白32(Annexins 32)或膜联蛋白B1(AnnexinsB1)(孙树汉，王俊霞，陈蕊雯，等.中国寄生虫学与寄生虫病杂志，1997，15(1)：15-20；颜宏利，孙树汉，陈蕊雯.第二军医大学学报，2002，23(4)：381-383；Hongli Y，Shuhan S，Ruiwen C，et al.Mol Biochem Parasitol.2002，119(1)：1-5；Zhang Y，Wang KH，Guo YJ，et al.Biol Chem.2007，388(6)：601-610.)。该抗原可用作为人、猪囊尾蚴病的诊断性抗原，同时，它还是囊尾蚴病的一个较好的疫苗候选分子，对囊尾蚴病有较好的保护性(吴丹，郭瀛军，林懿，等.第二军医大学学报，2000，21(6)：508-510；Li DA，He Y，Guo YJ，et al.Vaccine.2007，25(5)：932-938.)。然而，无论是作为诊断性抗原或亚单位疫苗，稳定高效的表达都是其有效应用的重要前提。

重组蛋白在大肠杆菌中能否表达及高表达受很多因素的影响，如大肠杆菌菌株、原核表达载体、诱导时间和温度以及诱导剂使用浓度等。曾有研究采用pGEX表达系统表达cC1融合蛋白，尽管亦可获得较高的表达量，但其纯化标签蛋白为日本血吸虫谷胱甘肽转移酶(GST)，其分子量较大，对目的蛋白的结构和功能可能产生较多影响，通常需要切除(陈蕊雯，林懿，孙树汉.中国寄生虫学与寄生虫病杂志，2000，18(1)：37-39.)。而且，在日本血吸虫流行区，人群中抗GST抗体阳性者有较大比例，如用pGEX表达系统表达的cC1重组蛋白作为诊断用抗原，则必须切除融合和GST标签，否则，会引起交叉反应，导致假阳性结果的出现。而这势必则增加了cC1蛋白表达纯化的难度和成本。为了获得大量廉价高纯度的重组cC1蛋白，zhang等曾尝试用pJLA503表达系统表达非融合性cC1蛋白蛋白，尽管其最终获得了纯度高达98％的cC1重组蛋白，但其需要2步色谱纯化，且最终得率仅为cC1重组蛋白表达量的10％，而在该系统，cC1重组蛋白表达量则仅为总菌体蛋白量的35.2％(Zhang Y，Guo YJ，Sun SH，et al.Zhang Y，Guo YJ，Sun SH，et al.Protein Expr Purif.2004，34(1)：68-74.)。

因此，本领域迫切需要一种能够稳定高效表达可溶性的、易于纯化的、对蛋白结构功能影响不大的、与其他疾病标志无交叉反应的猪囊尾蚴期特异性抗原cC1的表达方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种重组猪囊尾蚴期特异性抗原cC1的高效可溶性表达方法，具体是将猪囊尾蚴期特异性抗原cC1基因插入pET28a载体，并转化入宿主菌，获得一种重组猪囊尾蚴期特异性抗原cC1表达菌株；继而对诱导表达方法进行选择，获得稳定高效可溶性表达重组猪囊尾蚴期特异性抗原cC1的工艺方法。

本发明提供了一种重组猪囊尾蚴期特异性抗原cC1的表达载体pET28a-cC1，该载体含有猪囊尾蚴期特异性抗原cC1基因，它插入载体pET28a。

所述的表达载体pET28a-cC1的构建：

根据猪囊尾蚴期特异性抗原cC1基因序列(SEQ ID NO.1)合成2条引物(引物1：5′-GGATCCATGGCCTACTGTCGCTCC-3′(SEQ ID NO.2)，引物2：5′-CTCGAGTTATGCAGGGCCGATGAG-3′(SEQ ID NO.3))，提取猪囊尾蚴总RNA，以RT-PCR扩增出猪囊尾蚴期特异性抗原cC1基因，将PCR产物和载体pET28a分别以BamHI、XhoI酶切后，T4DNA连接酶连接，将猪囊尾蚴期特异性抗原cC 1基因插入载体pET28a的BamHI、XhoI之间。

上述PCR和酶切、连接反应的方法在本领域是已知的，具体操作按相关试剂说明书进行。