[发明专利]一种含毛囊组织工程皮肤的制备方法

权利要求书

1.一种含毛囊组织工程皮肤的制备方法，其特征在于，是将组织工程毛囊均匀接种于由支架材料与细胞复合形成的组织工程真皮层中，再覆以表皮细胞，经培养后即形成含毛囊的组织工程皮肤；所述的组织工程毛囊是将间充质来源的毛乳头细胞或可向毛乳头细胞分化的干细胞包裹于高分子材料中形成粒径为200～1000μm的微囊，再采用旋转培养方法将毛囊外根鞘细胞或是具有干细胞功能的上皮类细胞包裹于微囊外围，形成粒径为250～1100μm的组织工程毛囊；所述的支架材料与所述的高分子材料一样，为机体可接受的生物可降解材料。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，具体步骤包括：

步骤一、配制培养液

培养液A：在含有V/V为15％胎牛血清的商用DMEM培养液500ml中，加有表皮生长因子EGF 2～10μg、成纤维细胞生长因子bFGF 5～50ng、牛垂体提取物BPE 3～15g；

培养液B：在无血清商用Williams E培养液500ml中，加有EGF 2～10μg、bFGF 5～50ng、BPE 3～15g、胰岛素样生长因子IGF-15～50ng；

培养液C：在含有V/V为10％胎牛血清的商用DMEM培养液500ml中，加有胰岛素2～50ng、氢化可的松10～500μg、腺嘌呤10～17mg、Vc 5～30mg、EGF 2～10μg、bFGF 5～50ng、BPE 3～15g；

培养液D：在培养液C中含有0.1～1mM浓度的氯化钙；

培养液E：在培养液C中含有0.2～2mM浓度的氯化钙；

培养液F：在培养液C中含有0.3～3mM浓度的氯化钙；

步骤二、获取细胞

获取生长状态良好的毛乳头细胞，对不同来源的干细胞需经毛乳头细胞培养上清液的诱导培养；获取生长状态良好的毛囊外根鞘细胞，对其他上皮来源的干细胞无需诱导；

步骤三、制备组织工程毛囊

将含有细胞的微囊与获取的毛囊外根鞘细胞或其他上皮来源的干细胞混合，用培养液A采用旋转培养1～3天，待细胞贴附于微囊，以300rpm离心弃去上清，换培养液B培养2～4天，获得组织工程毛囊；

步骤四、含毛囊组织工程皮肤的制备

4℃条件下，用0.5M的醋酸溶液将支架材料配制成6～20mg/ml的溶液，冰浴下紫外线照射，再分别加入10％体积比的胎牛血清和终浓度为80～150mg/ml的DMEM商用培养基，调pH7.2～7.4，制成凝胶溶液；将尼龙膜浸透凝胶溶液，置于培养皿中固化形成支撑膜；把体外培养的成纤维细胞以10⁵～10⁶个/ml的密度混合于凝胶，将其滴加至已固化的支撑膜表面，37℃培养固化后形成真皮层，加入培养液C培养2～4天，每天换液；真皮层培养完成后吸弃培养液，用针头在表面均匀打孔，孔间距为2～5mm；将培养的组织工程毛囊悬液按10～100个/cm²的密度滴加在真皮层表面，使悬液均匀渗入孔中；然后在真皮层表面按10⁵～10⁶个/cm²的密度接种表皮细胞，加入培养液D培养1天后，移至支架上进行液下培养2～4天；更换培养液E进行气-液面培养1～2天；更换培养液F培养1～2天；培养期间每天换液。