[发明专利]一种人工合成的新抗菌肽及其制备方法和应用

说明书

技术领域：

本发明涉及一种人工合成的新抗菌肽、其制备方法和在制备治疗革兰氏阳性菌、革兰氏 阴性菌和真菌感染的药物中的应用。

背景技术：

抗菌肽(Antibacterial peptide)又叫抗微生物肽(Antimicrobial peptide)、抗生素肽 (Antibiotics peptide)，是由多种生物细胞特定基因编码，经外界条件诱导产生的一类具有广谱 抗菌、抗病毒活性的多肽。抗菌肽在疾病治疗与预防中具有广阔的应用前景，可望成为新型 的抗菌和抗病毒药物。抗菌肽不仅自身具有良好的抗菌活性，不同抗菌肽与传统抗生素联用， 还可提高抗菌肽和传统抗生素的药物疗效，甚至拓宽传统抗生素的抗菌谱。传统抗生素通过 消除微生物生长或生存必不可少的条件，如使酶失活变性，来达到杀菌的目的，细菌只要改变 一种基因就足以抵抗此类抗生素的攻击；而抗菌肽则通过中和电荷的方法与细菌细胞膜相互 作用，从而穿透细胞膜达到杀菌目的，极大地减少了细菌产生耐药性的可能。目前已有十余 种抗菌肽进行临床前或临床研究。衍生于magainins的MSI 78已进入III期临床试验，主要用于 治疗糖尿病患者由多种微生物引起的脚部溃疡，研究结果证实，其效果与口服奥氟沙星的作用 相同，但不良反应相对较少。来自人嗜中性粒细胞中的抗菌肽BPI的N端21kDa的片段(Neuprex) 作为注射剂也已进入III期临床，它能够大幅降低小儿脑膜炎奈瑟氏球菌感染造成的死亡。

天然抗菌肽的肽链较长、合成成本高、抗菌活性低并且有很强的溶血副作用，因此临床 使用价值较低。因此如何减少多肽的氨基酸残基数并提高其抗菌活性，降低溶血副作用成为 抗菌肽药物开发的热点。目前的研究主要集中在对已知结构的天然抗菌肽进行功能改造，如 残基替换、构建杂合肽、截取部分序列等。但通过这种途径很难开发出结构新颖且比天然抗 菌肽具有更广泛抗菌谱的新型抗菌肽。因此本发明对抗菌肽序列进行全新设计并人工合成， 提供了一种不同于天然抗菌肽结构的新型抗菌肽KW-13。其由脯氨酸连接的两部分结构域组 成，N端的氨基酸用于增加正电荷含量，在此基础上C端另加一段标准的α螺旋结构(碱性氨 基酸-疏水性氨基酸-疏水性氨基酸-碱性氨基酸的重复序列)。发明人将本发明的KW-13全 序列氨基酸结构经NCBI蛋白质数据库进行搜寻比对，未发现有任何相同多肽；将本发明的 KW-13全序列氨基酸结构经APD抗菌肽数据库进行模拟预测，显示其具有良好的抗菌活性。

发明内容：

本发明的目的是基于抗菌肽分子设计理论和固相多肽合成技术，提供一种具有强烈抗菌 活性的新型抗菌肽KW-13。本发明的另一个目的是将这种抗菌肽应用于制备治疗革兰氏阳性 菌、革兰氏阴性菌和真菌感染的药物中。

为了实现本发明的目的，本发明提供了如下技术方案：

抗菌肽KW-13是一种直链多肽，含有13个氨基酸残基，分子量为1686Da。KW-13的全序 列为赖氨酸-色氨酸-赖氨酸-酪氨酸-脯氨酸-赖氨酸-亮氨酸-亮氨酸-赖氨酸-赖氨酸-亮氨酸-亮 氨酸-赖氨酸。

抗菌肽KW-13的制备方法：

根据所设计的KW-13氨基酸序列，利用固相多肽合成技术进行手工合成。将经保护的氨 基酸在Wang树脂上按预先设计的顺序从C端到N端逐个进行偶合并脱保护。合成的多肽经高 浓度的TFA剪切后，得到粗品。经HPLC反相柱进行纯化后通过质谱分析确证。合成的多肽溶 于灭菌水，利用96孔板法对其抗菌活性进行检测。

本发明的有益效果在于：

基于抗菌肽分子设计理论和固相多肽合成技术得到的新抗菌肽KW-13具有结构简单、人 工合成方便和广谱抗菌等有益特点。另外KW-13不含有稀有氨基酸和外源化学成分，是一种 极具应用潜力且安全的抗菌替代物。

具体实施方式：

下面用实施例来进一步说明本发明的实质性内容。应当理解这些实施例仅用于说明本发 明而非对本发明有任何限制。

实施例1抗菌肽的制备及分离纯化

按下述序列制备KW-13。

KW-13的全序列：

赖氨酸-色氨酸-赖氨酸-酪氨酸-脯氨酸-赖氨酸-亮氨酸-亮氨酸-赖氨酸-赖氨酸-亮氨酸-亮 氨酸-赖氨酸。