[发明专利]基于荧光标记的肝毒性物质筛选和评价方法

说明书

技术领域

本发明属于物质毒理学筛选与评价方法领域，涉及应用荧光探针特异性标记细胞、细胞显微图像自动获取技术、荧光图像识别及数据生成，通过分析图像信息来获取肝毒性物质相关指标并用于外源物的肝毒性筛选和评价，同时该方法可以扩展应用于其他细胞毒性物质的筛选与评价(如肾毒性、心肌毒性、抗肿瘤等)。

背景技术

肝脏是药物及外源性物质在体内代谢的最主要场所，很多药物在体内发挥防病治病作用的同时，不可避免地会影响肝脏的结构与功能，导致不同机理的药物性肝损伤。据统计，在已上市应用的药物中，有1100种以上的药物具有潜在的肝毒性，很多药物的赋形剂、中草药以及保健药亦有导致肝损伤的可能。在美国有1％肝炎患者是因药物引起的。在我国，药物性肝炎所占的比例约占急性肝炎住院患者的10％。据统计，有大约30％的候选药物在审批阶段未获通过，是由于其细胞毒性以及临床安全性方面存在问题。而从1961到1992年在法国、德国、英国、美国等国家，因其肝脏毒性而撤出市场的药物占总被撤销药物的18％。多年来，肝毒性是导致药物被从市场撤回、被限用或被拒批的最重要的原因，已经成为阻碍新药候选药物开发的重要因素。

同时，近年来中草药在临床应用的普及，尤其是在慢性肝病等疾病治疗中的应用日益增多，随之所引起的不良反应也逐渐增多，甚至因中草药中毒致死的病例也时有报道。中草药所致的肝损伤占临床药物性肝损伤总病例的4.8％～32.6％。这些因中草药的而导致的不良反应多是由于长期使用以及过量使用导致，中草药中含有的毒性成分如，生物碱、苷类等成分都会引起肝损伤。说明中草药并不是因其天然而无不良反应的，但是需要指出的是，只是某些中草药具有潜在的肝毒性，但其尚不在药物性肝损伤中占主要地位。必须辩证的看待中草药的药理活性与毒性，同时还需规范药材种植的GAP管理以及制剂生产标准化，进一步提高对中草药的安全性的正确认识。因此需要积极研究能够快速筛选并鉴定具有肝毒性的化学物质、以及中草药中导致不良反应的成分的方法，建立快速的筛选和评价模型，将肝毒性检测放在药物研发的早期阶段。

目前，药物开发阶段毒性评价模型(包括肝毒性)是基于临床前的动物模型(如，啮齿类的大鼠，非啮齿类的犬)和临床III期人体试验评价。虽然以动物模型来预测一个候选药物在人体是否有毒性存在不一致的例子，即在动物实验表明安全的候选药物在开展人体试验时候存在毒性的现象，但是有一个共识即使动物模型不能完全预测人类的疾病，动物模型对于药物开发还是有价值的并且是关键的，值得资金的投入。但是，动物模型评价药物安全性存在诸如动物消耗量大，资金投入多，劳动强度高等问题。有必要在动物实验阶段之前开展体外毒性预测，通过毒性筛选提高候选药物的质量。常规的体外毒性筛选方法包括LDH释放、MTT法、SRB法以及细胞内ATP含量测定等，量效以IC₅₀表示，当体外测定的IC₅₀值不超过体内毒性浓度值的5～10倍时则被认为该体外毒性预测模型是合理的。但是这些方法存在速度慢、灵敏度低及自动化程度低等不足，难以满足化合物库以及中草药中多成分高通量筛选的需求。基于细胞的高通量(HTS)、高内涵筛选(HCS)应运而生。尤其是HCS已经应用于药物开发的早期阶段。HCS的优势在于具有自动化，高通量的特点，能够通过荧光标记细胞或亚细胞器实现细胞计数、细胞形态学统计、亚细胞器功能改变，离子浓度变化、受体功能改变及DNA等遗传物质改变的定性与定量分析；具备单次测量，获得多参数的功能。由于是在细胞完整的生理结构及功能网络环境下开展毒性筛选实验，比基于离体的受体、酶等大分子的筛选结果更可信，一些大型的制药企业更是将HCS用于化合物小分子库的细胞活性、毒性以及遗传毒性等方面的筛选。但是往往商业化的HCS设备价格都很昂贵，在国外也只有大型制药企业才有能力使用；目前国内也只有少数几家科研院所单位拥有相关设备。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于荧光标记细胞状态的肝毒性物质筛选和评价方法，是一套结合硬件/软件系统的筛选和评价方法。具体通过以下步骤实现：

1.硬件和软件系统