[发明专利]一种通用可靠的土壤总DNA的提取方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种土壤总DNA提取方法，尤其涉及一种通用可靠的土壤总DNA提取方法及其在各类土壤样品中的应用。

背景技术

土壤中含有非常丰富的微生物资源，但由于受到研究方法和研究手段的限制，土壤中绝大多数微生物还不为人所知。分子微生物生态学研究表明，利用传统的纯培养技术，仅有1％的微生物可被培养，而未能培养的微生物才是土壤微生物多样性的主体(Amann RI.et al，1995)，这给微生物的多样性资源开发和利用带来很大的局限。

在分子水平上研究土壤中未可培养微生物的技术关键之一是从各种土壤样品中获得可进行分子操作的宏基因组DNA。获得高纯度、大片段、完整性好的土壤微生物总DNA是土壤微生物分子生态学研究和宏基因组文库构建的基础。由于土壤样品种类繁多、成分复杂、物化性质多变，含有大量的无机及有机化合物，存在着对某些酶反应的抑制剂，如腐植酸、腐植酸类似物、重金属离子等都会干扰提取反应的进行。加之，微生物细胞通常紧密吸附于土壤颗粒表面。因此，从土壤样品中提取出高质量的、具有代表性的微生物总基因组DNA具有相当难度。因此，建立土壤样品DNA的提取纯化方法对于在分子水平上研究未培养微生物具有重要意义。

虽然目前对土壤DNA提取方法的研究报道已有很多，但没有一种方法能适用于所有的土壤样品，而且大部分方法都需要再纯化过程，也没有一种方法能满足不同的实验条件和实验目的。

发明内容

为了解决上述现有技术中存在的不足，本发明首要目的在于提供一种能够提取各种类型土壤总DNA的方法。

本发明所涉及的土壤样品类型包括大田作物土壤、保护地土壤、浅海污泥、深海污泥、用于污水处理的活性污泥、高盐碱土壤、酸性土壤等类型。

本发明的目的通过下述方案实现：

一种通用可靠的土壤总DNA的提取方法，其特征是包括以下步骤：

(1)土壤样品预处理：

用10mL pH 8.0的0.12mol/L的磷酸钠缓冲液洗涤土壤样品5g，8000r/min离心10min，沉淀再洗涤一次；

(2)裂解细胞：

将步骤(1)中的沉淀中加入5mL溶液I，37℃水浴10min，然后加入5mL溶液II，65℃水浴1h，每隔15分钟摇晃，离心10min(6000r/min)弃沉淀；上清中加入2.7mL 5mol/L NaCl，混匀，在65℃水浴中放置5min；

(3)除去蛋白并沉淀DNA：

用氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提两次，8000r/min离心；得到的上层水相与等体积的溶液III(13％聚乙二醇8,000，1.6mol/L NaCl)混合，冰上静置20min；离心10min(10000r/min)弃上清，沉淀用70％乙醇洗涤一遍，室温干燥；

(4)除去腐殖酸等杂质：

干燥后溶于3ml TE(10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA，pH 8.0)中；加入707μl(7.5mol/L)醋酸钾溶液，混合物在室温条件下放置30min，离心10min(8000r/min)，弃沉淀；上清中加入0.6倍体积的冰异丙醇，混匀后静置10min；沉淀用70％乙醇洗涤后干燥，用90μlTE溶解DNA，加入等体积2mol/L氯化镁溶液，混匀，室温静置30min，离心10min(8000r/min)，弃沉淀；上清中加入0.6倍体积的异丙醇沉淀，于70％乙醇洗涤沉淀后干燥，TE溶解；

所述的溶液I各成分含量为：0.15mol/L NaCl，0.1mol/L EDTA，15mg/mllysozym，pH 8.0；

所述的溶液II各成分含量为：0.1mol/L NaCl，0.5mol/L Tris-HCl，10％SDS，pH 8.0。

取利用本发明方法分别以白菜地、玉米地、葱地、森林地、保护地、松树、槐树地、柞树地、柏树、温室沙地、近海污泥、深海污泥样品提取的土壤总DNA，经1.0％琼脂糖凝胶电泳后用0.5％EB染色结果。结果显示：各种样品中的DNA条带清晰且单一，无拖尾，无杂带，与λ-Hind III Maker对比均能保证在23kb以上，说明具有较好的完整性。详见实施例1-实施例12；