[发明专利]用DNA检测技术分析羊绒质量的方法

说明书

技术领域：

本发明涉及生物DNA检测技术的应用，特别是一种用DNA检测技术分析羊绒质量的方法。

背景技术：

世界上的羊绒制品主要有绵羊绒和山羊绒两种。因为山羊绒比绵羊绒细腻、柔软、保暖性好，所以它的质量和价格都高于绵羊绒。少数不法之徒为牟取暴利人为地将绵羊绒掺入山羊绒，严重地损害了消费者利益。中国现有的山羊绒和绵羊绒的鉴定办法是用显微镜观察羊绒纤维的结构，利用其表面结构的不同来区分二者。

现有技术的最明显的缺陷在于：1.鉴定的主观性：鉴定全靠技术人员的经验判断，没有任何科学数据；2.鉴定方法的不确定性：鉴定方法全靠定性描述，他人很难重复；3.无法鉴定深度处理过的羊毛。深度处理过的羊毛，如深度染色等，因为羊毛结构或光学特性发生了变化，现有方法无法鉴定。

从进化来看，山羊(Capra hircus)和绵羊(Ovis aries)属于不同的属，他们大约在5至8百万年前就在生殖上相互分离了，他们的DNA有相当大的差异。

发明内容：

本发明的目的是克服现有技术之不足，提供一种用DNA检测技术分析羊绒质量的方法，本发明的目的按照下述方案实现：

用DNA检测技术分析羊绒质量的方法，其检测过程为：先从待测样品上提取DNA，再用绵羊或山羊探针进行实时聚合酶链式反应，最后对反应结果进行数值分析得出样品中山羊绒或绵羊绒的含量；

上述实时聚合酶链式反应的过程为，先制备绵羊TaqMan MGB探针和山羊TaqMan MGB探针，在试管内，分别与待测样品DNA进行实时聚合酶链式反应，反应所加试剂有：1xPCR缓冲液、MgCl₂、dNTP、PCR正向引物、PCR反向引物、TaqMan MGB探针、GoldTaq DNA聚合酶、DNA样品，反应温度95℃，11分钟，40个循环，每个循环，94℃ 30秒，65℃ 30秒，反应过程中实时测定试管内液体的相对荧光量；

上述绵羊TaqMan MGB探针为：FAM-ataattataaaaacaaaa-MGB，山羊TaqManMGB探针为：FAM-ataattacagaaacaaaa-MGB，其中，FAM是荧光染料6-carboxyfluorescein的缩写，MBG是猝光剂dihydrocyclopyrroloindole tripeptideMinor Groove Binder的缩写；

上述山羊绒含量的分析过程为：先制备不同山羊DNA浓度的标准样，与山羊TaqMan MGB探针进行实时聚合酶链式反应，测定其相对荧光量，根据结果制出标准曲线或归纳线性方程式，对待测样品在同等条件下进行实时聚合酶链式反应，测定其相对荧光量，对照结果可以得出样品中山羊绒含量；

上述绵羊绒含量的分析过程为：先制备不同绵羊DNA浓度的标准样，与绵羊TaqMan MGB探针进行实时聚合酶链式反应，测定其相对荧光量，根据结果制出标准曲线或归纳线性方程式，对待测样品在同等条件下进行实时聚合酶链式反应，测定其相对荧光量，对照结果可以得出样品中绵羊绒含量。

本发明从根本上克服了现有技术的主观性，不确定性，使得鉴定深度加工的含羊绒制品成为现实，羊毛、羊绒鉴定从一门艺术变成了现代科技。

附图说明：

图1是山羊和绵羊线粒体DNA基因片段序列比较图；

图2是TaqMan MGB反应的图解图；

图3是绵羊毛DNA样品与山羊或绵羊的TaqMan MGB探针反应结果图；

图4是山羊毛DNA样品与山羊或绵羊的TaqMan MGB探针反应结果图；

图5是不同浓度的山羊DNA在山羊TaqMan探针中的反应结果图；

图6是山羊DNA量的对数与其Ct作图得到的标准曲线图；

图7是绵羊DNA量的对数与其Ct作图得到的标准曲线图；

具体实施方式：

通过系统比较山羊和绵羊线粒体DNA，发现其12S rRNA基因是一个能区分山羊和绵羊的优良检测目标。如附图1所示，“Query”是绵羊的12S rRNA基因片段，“Sbjct”是山羊的12S rRNA基因片段，他们之间相同的碱基用竖线标出，而不同的碱基则用空格标出。

在上述碱基序列第238和240位置处绵羊和山羊DNA产生了变异，分别从T变成了C和从A变成了G。由此，我们订制了绵羊和山羊专一的TaqMan MGB探针，如下：

绵羊TaqMan MGB探针：FAM-ataattataaaaacaaaa-MGB