[发明专利]一种双佐剂用于生产灭活疫苗的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物制剂的制备，采用双佐剂复配用于生产灭活疫苗，达到增强灭活疫苗免疫的技术效果。

背景技术

佐剂(Adjuvant)一词来源于拉丁语，原为辅助之意。佐剂在免疫中的作用主要是提升机体免疫系统(体液或细胞免疫系统)对抗原或免疫原的免疫应答反应，包括增强免疫反应强度和反应的持久性。随着生物技术的发展，疫苗的更新换代越来越快；其中，选择合适的佐剂的已成为提高疫苗质量的重要手段，受到了科技工作者的重视。文献检索披露：国家药典和生物制品书籍中灭活疫苗均使用单个佐剂，例如矿物油佐剂，206佐剂，氢氧化铝胶佐剂，中药免疫佐剂，蜂胶佐剂等文献资料。例如①中国农业科学院兰州兽医研究所王永录等人发明了口蹄疫O、A、Asia-1型三价灭活疫苗(专利申请号200710018543)的佐剂为蒙太得206佐剂--Montanide ISA 206佐剂。②中国农业大学康友敏进行了增强口蹄疫疫苗免疫反应及其调节机制的研究，将左旋咪唑(LMS)作为口蹄疫灭活疫苗的佐剂，并进行了效果研究。③南京联海化工有限公司陈锡武等人发明了一种灭活疫苗的油佐剂(专利申请号200910028379)，由注射白油和甘露醇油酸脂按90∶10～100∶8的体积份混合而成。④北京生泰尔生物科技有限公司江厚生等人发明了一种新型疫苗佐剂(专利申请号200710165168)，其制备方法为：将几种免疫增强剂和表面活性剂分别溶于水和油中，然后进行乳化配制和纳米处理，制备得到一种新型纳米微粒佐剂。上述文献的佐剂均为左旋咪唑，或注射白油和甘露醇油酸脂混合物，或纳米微粒佐剂，或206油佐剂。

本发明在口蹄疫灭活疫苗常规使用的法国SEPPIC公司Montanide ISA206佐剂206佐剂的基础上，设计了一种缓释作用更强的双佐剂生产疫苗，用于配制口蹄疫O型、亚洲1型二价灭活疫苗、A型单价灭活疫苗与常规206佐剂配制的口蹄疫O型、亚洲1型二价灭活疫苗、铝胶佐剂配制的A型单价灭活疫苗进行的免疫，达到了设计效果；也可用于其他灭活疫苗。

发明内容

本发明的目的在于：提供的缓释作用更强的双佐剂生产疫苗，能提高灭活疫苗质量，增强免疫效力和延长免疫持续期等。

本发明的目的是这样实现的：一种双佐剂用于生产灭活疫苗的制备方法，包括对病毒液的接种、纯化、浓缩、环化、灭活阻断的预处置，将提取的病毒液加入以百分比配制佐剂1和佐剂2，佐剂1氢氧化铝胶的用量为1-50％；佐剂2Montanide ISA 206佐剂的用量为1-50％或用氢氧化铝胶佐剂1-50％、白油1-50％、吐温-80为1-10％、司盘-20为1-10％：经复合，将佐剂1充分搅拌、吸附静置沉淀，弃去上清液，再加入佐剂2乳化即可获取灭活疫苗。

所述生产灭活疫苗的方法，采用双佐剂用于生产配制口蹄疫O型灭活疫苗、口蹄疫O型、亚洲1型二价灭活疫苗；口蹄疫O型、亚洲1型和A型三价灭活疫苗；A型单价灭活疫苗与常规206佐剂配制的口蹄疫O型灭活疫苗；口蹄疫O型、亚洲1型二价灭活疫苗；口蹄疫O型、亚洲1型和A型三价灭活疫苗；铝胶佐剂配制的A型单价灭活疫苗进行了免疫效果更好。

所述生产灭活疫苗的方法，选用的佐剂药剂均为市售产品。

该双佐剂配制的口蹄疫O型、亚洲1型二价灭活疫苗、A型单价灭活疫苗与常规206佐剂配制的口蹄疫O型、亚洲1型二价灭活疫苗、铝胶佐剂配制的A型单价灭活疫苗进行了免疫，效果极佳。

该双佐剂对免疫后的动物，通过MTT法检测淋巴细胞增殖能力、液相阻断ELISA法检测口蹄疫抗体效价以及攻击病毒测定PD₅₀试验来评判，该双佐剂疫苗与常规疫苗的效果差异十分明显：①口蹄疫O型、亚洲1型二价灭活疫苗双佐剂疫苗组细胞免疫水平(淋巴细胞刺激指数SI为1.235±0.060)比常规206佐剂疫苗组(SI为1.115±0.035)和对照组(SI为1.010±0.045)高，与常规206疫苗组相比差异显著(0.01＜P＜0.05)，与空白对照组相比，差异极显著(P＜0.01)。②双佐剂疫苗组O型和Asia-1抗体与常规佐剂疫苗组相比，全剂量组抗原量较充分，两组抗体水平差距不大；1/3剂量组和1/9剂量组由于抗原量较少和强缓释作用，导致抗体水平明显较低。③攻毒保护结果为双佐剂疫苗组略高于常规佐剂疫苗组，前者每头份疫苗亚洲I型为9.0PD₅₀，O型为11.84PD₅₀，后者每头份疫苗亚洲I型为9.0PD₅₀，O型为9.0PD₅₀。