[发明专利]山葡萄酒中酒石酸降解菌的筛选方法及应用

权利要求书

1.一种山葡萄酒中酒石酸降解菌的筛选方法，其特征在于：降解山葡萄酒中酒石酸的有效菌为黑曲霉，具体的筛选方法如下：采集葡萄园土壤和生产酒石酸工厂附近的土壤的土样2g定量加到盛有100mL无菌生理盐水的三角瓶中，并加入8～12粒无菌玻璃珠(直径为3～5mm)，充分振荡后静置，取上清液再分别加入到以浓度为2g/L的酒石酸为唯一碳源的液体富集培养基中进行富集培养，培养条件为28℃，160r/min，摇床振荡培养，以72h为一个周期，每个周期结束后，按照以上的操作，依次将所培养的菌液转接入新鲜的富集培养基中，同时酒石酸浓度由2g/L、4g/L、6g/L、8g/L逐渐递增到10g/L；再通过初筛和复筛后选出对酒石酸具有较好降酸效果的菌种黑曲霉；将筛选得到的降酸菌——黑曲霉用平板划线法进行多次分离纯化后，挑取单菌落接入到YEPD斜面培养基上于28℃培养72h后4℃保存。

2.根据权利要求1所示的一种山葡萄酒中酒石酸降解菌的筛选方法，其特征在于所述的降酸应用过程如下：

将山葡萄原料进行破碎后加入0.05％的果胶酶和100mg/L的SO₂，浸汁12小时后用汁渣分离机进行分离压榨出汁，澄清后进行降酸发酵，在30～35℃条件下接入酒石酸降解菌——黑曲霉后再对葡萄汁进行澄清处理，酒精发酵是在20～25℃条件下接入酿酒酵母菌，酒精发酵结束后再进行澄清、分离，最后进入陈酿工序。

3.根据权利要求1所示的一种山葡萄酒中酒石酸降解菌的筛选方法，其特征在于所述的初筛过程如下：在富集培养后取一定量的富集菌液，用生理盐水稀释到10^-5，选择10^-3、10^-4、10^-5稀释度，分别吸取0.5mL稀释液涂布于含酒石酸浓度为10g/L的琼脂平板培养基上，28℃恒温培养72h。将所得的典型单菌落点植于分离培养基上，相同条件下培养。

4.根据权利要求1所示的一种山葡萄酒中酒石酸降解菌的筛选方法，其特征在于所述的复筛过程如下：将初筛所得到的单菌落用平板划线法进行多次分离纯化，挑取单菌落接入YEPD斜面培养基于28℃培养72h后4℃保存。

5.根据权利要求1所示的一种山葡萄酒中酒石酸降解菌的筛选方法，其特征在于所述的菌种鉴定方法如下：

(1)菌落形态观察；将分离出的菌株分别接种于各种类型的培养基上，在30℃下培养3-4d，对形成的菌落进行特征观察并记录。

(2)显微形态观察；采用光学显微镜观察菌株的细胞形态。

(3)生化试验鉴定；对筛选出的菌株做淀粉水解试验、明胶液化试验、MR试验、硝酸盐还原试验等各种生化鉴定试验，观察菌株对各种碳源和氮源的利用情况。

(4)分子生物学鉴定；测定该菌株的ITS保守序列组成，并与Genbank中的相关序列进行比对，以确定该菌的具体种类。结果得出该菌株的ITS基因序列与黑曲霉的同源性和相似性分别为98％、99％，可鉴定该菌株为半知菌类[Fungi Imperfecti]、曲霉属[AspergillusMicheli ex Fr.]中的黑曲霉组[A.niger]。