[发明专利]一种促进10-羟基喜树碱生物合成的方法

权利要求书

1.一种促进10-羟基喜树碱生物合成的方法，其特征在于该方法如下：

(1)喜树植物的叶在含激素的MS培养基上诱导愈伤组织；

(2)愈伤组织在含激素的MS培养基上继代培养以获得细胞培养系；

(3)喜树细胞悬浮培养使用的液体培养基为含激素的MS培养基；

(4)在喜树细胞悬浮培养液中加入硝酸钴2～200μMol/L、硝酸镧2～500μMol/L和水杨酸0.05～10mg/L；

(5)在喜树细胞培养后期接种刺囊毛霉(Mucor spinosus)和黑曲霉(Aspergillus.niger)进行生物转化；

(6)喜树细胞培养物与乙醇溶液进行匀浆处理并滤过，得到含有10-羟基喜树碱的滤液；

其中在步骤(1)、(2)、(3)中使用的激素为6-苄基腺嘌呤和2，4-二氯苯氧乙酸，它们联合使用，用量分别为0.1～2.5mg/L。

2.根据权利要求1所述的方法，喜树细胞悬浮培养的条件是：在MS培养基中含有0.1～2.5mg/L 6-苄基腺嘌呤和0.2～1.2mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸的激素组合，pH值为4.5～7.5；接种量为8～15％(W/V，g/ml)；培养温度为20～35℃，通气量为0.1～0.8L/min，培养时间为16～25天。

3.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(4)中硝酸钴和硝酸镧的添加时间分别在细胞悬浮培养的第1～5天；水杨酸的添加时间为细胞悬浮培养的第5～20天。

4.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(5)中生物转化的条件是：在喜树细胞培养期的第5～25天接种5～20％(W/V，g/ml)的刺囊毛霉(Mucor spinosus)，1～100小时后接种1～20％(W/V，g/ml)的黑曲霉(Aspergillus.niger)；初始PH值为4.5～7.5，通气量为0.1～1.0L/min，培养温度为25～35℃，在接种黑曲霉(Aspergillus.nigr)后再培养转化1～360小时。

5.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(6)中乙醇溶液的浓度为40～95％(V/V)，乙醇溶液的加入量为喜树细胞培养物鲜重的2～15倍。