[发明专利]用于定量检测BCRP突变的试剂盒

说明书

发明背景

多药耐药(multidrug resistance，MDR)是肿瘤的重要耐药机制，是肿瘤化疗失败的主要原因之一。在人类耐药肿瘤细胞中，MDR包括几种转运蛋白：P-g蛋白(P-glyeoprotein，P-gp)、多药耐药相关蛋白(multidrug resistance-accosiated protein，MRP1～7)和乳腺癌耐药蛋白(breast cancer resistance protein，BCRP)，这些蛋白都属于ATP结合盒(adenosine triphosphat binding cassette，ABC)膜转运蛋白超家族。它们作为药物排泵，可以导致胞内的细胞毒药物浓度降低，使肿瘤细胞对多种肿瘤药物产生耐药。BCRP作为新近发现的一个家族成员，在多药耐药方面有着不可忽视的地位。

人ABCG2基因含有16个外显子，总长为66kb，位于4q22染色体上，是迄今为止在4号染色体上发现的唯一ABC转运蛋白(AllikmetsR，et al，Cancer Res，1998，58(23)：5337-5339)。ABCG2基因的变化直接影响到癌细胞对抗癌药物的外排能力，从而改变患者对药物的敏感性.Robey等利用不同药物处理HEK-293(人胚肾)细胞发现它所表达的ABCG2会显示不同的药物谱，这些因不同药物而自然发生的单一位点突变体R482G或R482T，均比野生株对米拖蒽醌(mitoxantrone)或阿霉素(doxorubicin)表现出更高的抗药性，而且转运罗丹明123(rhodamine123)的能力也加强，底物谱也更宽，因而被称为功能获得性(gain-of-function)突变体(Robey R W，et al，Br J Cancer，2003，89(10)：1971～1978)。因此通过对BCRP基因的突变检测，可以对相关抗肿瘤药物的治疗效果做出一定的前瞻性评估，实现肿瘤病人的个体化治疗，从而达到良好的预后。

目前BCRP基因突变点主要集中于第482位氨基酸密码子，其中AGG碱基突变为GGG或ACG碱基为最常见的突变类型。本发明通过实时定量PCR方法检测分子靶向抗肿瘤药疗效相关的肿瘤相关基因BCRP 482位氨基酸密码子2种类型的突变情况，来预测肿瘤药物的的耐药性情况。

本发明采用的检测方法具有以下几个优点：操作简单，易于标准化。其它方法如等位基因特异的寡核苷酸探针杂交法，对杂交的条件非常敏感，需要严格控制实验条件；限制性片段长度多态性实验需投入相当的人力操作，且不能定量。实验周期短，2小时内就可以完成。不需要测序验证结果，而直接测序法与高分辨溶解曲线分析需要4天-2周。敏感度高，我们通过对实验条件进行优化，突变检测的敏感度可达到1％，而直接测序法敏感度20-50％。特异性高，免疫组化方法假阳性与假阴性率高，且不能确定点突变的位置和类型；定量准确，这是本发明实验方法最独特的优点，通过绝对定量法处理数据，从而绘制标准曲线，精确测定样本中野生型与突变型基因的含量，进而得到突变型基因所占比例，辅助临床诊断和用药。另外，本发明安全无毒性，其它方法如错配碱基的化学断裂法需要用到同位素和剧毒化学试剂。

发明内容

本发明要解决的问题是提供一种BCRP基因突变的定量检测试剂盒。定量检测BCRP基因482位氨基酸密码子AGG碱基突变为GGG或ACG碱基的情况。

为解决上述问题，本发明提供包含Taq酶、10×Taq缓冲液、MgCl₂、dNTP混合液及可特异性扩增BCRP基因突变位点序列的PCR引物与可特异性识别野生型与突变型序列的探针的定量检测试剂盒及检测方法：

(1)分别在BCRP基因482位密码子突变位点附近设计上下游引物，以及根据每个突变位点的突变情况设计特异性的探针，该探针可与BCRP特定位点的野生型或欲检测的突变型序列特异性结合，从而确定该位点有无发生所检测的基因突变。

(2)为精确定量所测BCRP突变比例，本发明设计了标准品。

(3)对待测样品与标准品进行荧光定量PCR检测。

(4)由标准品检测结果得到用于定量的标准曲线，由标准曲线计算得到待测样品核酸的BCRP基因突变占总体BCRP基因的比例。

所述步骤(1)之前还包括：对待测样品中的核酸进行提取、纯化和浓度测定。