[发明专利]选择和扩增多核苷酸的方法

说明书

相关申请的交叉引用

本国际申请在美国是2009年2月27日提交的目前未决的美国申请序列号12/395,299的部分延续申请，其对2008年3月10日提交的美国申请序列号61/035,254主张权益。

发明领域

本发明涉及核酸扩增领域。更具体地说，本实施方案提供了在固相载体上选择核酸样本的一个或多个区域以及直接在固相载体上生长核酸聚类(cluster)同时消除对多样本滴定步骤的需要的方法。

发明背景

本申请中引用了若干公开物和专利文件以更加完整地描述本发明所属领域的状态。这些公开物和文件的各自全部公开内容被引入本文作为参考。

高通量核酸测序的许多方法依赖于通用的扩增反应，其中DNA样本被随机片段化，然后处理，使得不同片段的末端都包含相同的DNA序列。含有通用末端的片段然后可以使用单对扩增寡核苷酸在单一反应中扩增。在扩增前将片段库分离到单一分子水平确保扩增分子形成离散群落，之后可以对其进一步分析。此类分离可以在乳液中或在表面上进行。或者，可以设计对核酸样本的某部分具有特异性的扩增寡核苷酸，因而除去修饰样本末端的需求。

多核苷酸阵列基于“固相”核酸扩增而形成。例如，可以使用桥式扩增反应，其中固定在固相载体上的模板被扩增，扩增产物在固相载体上形成以形成包含核酸聚类或“克隆”的阵列。此类阵列上的各个聚类或克隆由多个相同的固定的多核苷酸链和多个相同的固定的互补多核苷酸链形成。这样形成的阵列在本文中一般被称作“聚类阵列”。

与其它数种扩增技术相同，固相桥式扩增使用正向和反向扩增寡核苷酸，其包括“模板特异性”核苷酸序列，它们在扩增反应退火步骤的条件下能够与待扩增的模板或其互补者中的序列退火。模板中在扩增反应条件下与引物退火的序列，在本文中可以被称作“引物结合”序列。

聚类方法的某些实施方案使用“通用的”引物来扩增可变的待扩增的模板部分，所述模板部分的5′和3′端与常用或“通用的”引物结合序列相接。“通用的”正向和反向引物包括能够与模板构建物中的“通用的”引物结合序列退火的序列。可变的模板部分或“靶”自身可以是已知、未知或部分已知的序列。这一方法具有的优点是不必为待扩增的各个靶序列设计特异性引物对；假使各个模板通过在其5′和3′端添加了相同的通用引物结合序列而被修饰，相同引物可被用来扩增不同的模板。因此，可变的靶序列可以是感兴趣的任意DNA片段。假使混合物中的各个模板分子通过添加相同的通用引物结合序列而被修饰，可以使用类似方法通过使用单对通用的正向和反向引物来扩增多模板(具有已知末端的靶)的混合物，例如多个靶核酸分子(例如基因组DNA片段)或靶核酸分子库。

此类PCR扩增特别是固相桥式扩增的“通用引物”法是有益的，因为它们使得相同或不同、序列已知或未知的多个模板分子能够在单个扩增反应中扩增，所述反应可以在具有单对“通用”引物的固相载体上进行。不同序列的模板的混合物的同时扩增，还可以使用多个引物对进行，每个引物对与混合物中的各独特模板互补。对模板的复杂混合物而言，为各个独立的模板生成多个引物对可能是繁琐且昂贵的。在某些应用(例如检测病毒或微生物感染的存在，或表征微生物群落)中，可能可以设计扩增寡核苷酸，使得仅有来自该微生物的核酸被扩增。

在聚类阵列的制备中，通常使用的模板浓度越高，在聚类阵列上产生的聚类密度将越高。如果聚类密度太高，可能难以单独地解析各个聚类，并可能形成重叠的克隆。可以进行滴定来确定最佳模板浓度，以在阵列上达到最佳聚类密度，其中的各个聚类可以单独被解析。但是，此类滴定可导致聚类密度太高或太低引起的有价值流通池(flow cell)通道的损失、模板样本损失、需要的试剂量增加、或样本处理时间增加。

因此，对控制和达到所需聚类密度的方法存在需求，其不依赖于原始核酸样本浓度而且避免了核酸滴定步骤。本发明满足了这一需求，而且还提供了其它优点。

发明概述