[发明专利]从人骨髓单核级分获得结缔间质干细胞的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种获得间质干细胞的方法。具体来说，本发明涉及一种从人骨髓细胞的单核级分获得间质干细胞的方法。所述方法包含获得所述单核骨髓级分的阶段，回收和预扩增间质干细胞的阶段，以及扩增间质干细胞直到获得可能的治疗应用所必需的临床剂量的阶段。

背景技术

间质干细胞(MSC)是多能细胞，已被证实可有效地治疗肌骨病变和提高心血管疾病中的心脏功能(Le Blanc K.，Pittenger M.，Mesenchymal stem cells：progress toward promise.Cytotherapy 2005；7：36-45)。MSC可从包括骨髓、脂肪组织和脐带血在内的多种成人组织分离。除此以外，这些细胞可在体外扩增。

单核骨髓级分(MMF)是通过基于离心从骨髓获得的血液的分离操作来获得。MMF是异种细胞群，其除了包含间质干细胞外，还可能包含造血祖细胞。相对于在MMF中同样存在的成熟造血细胞，这两个细胞群体以极小浓度存在。

Fridenshtein等人(Fridenshtein A.J.，Deriglazova U.F.，Kulagina N.N.等人Precursors for fibroblasts in different populations of hematopoietic cells as detected by the in vitro colony assay method.Exp.Hematol.1974第2卷第83-92页)最先从骨髓获得了间质干细胞，其技术是基于间质干细胞粘附塑料表面的能力，这是大多数造血细胞所不具有的性质。这种方法的缺点是间质细胞的回收产率很低，这可能是因为所述细胞在骨髓中的含量并不高，估计在0.001％与0.01％之间(Alhadlag A.和Mao J.Mesenchymal Stem Cells：Isolation and Therapeutics.Stem Cells and Development.2004.13：436-448(3))。然而，所述细胞与塑料粘附已被确立为获得间质干细胞的方法的进一步改良的起点。

Heynesworth等人使用胎牛血清作为培养基的补充物，已经成功获得了间质干细胞，其具有高粘附能力、高增殖水平且历经长时期仍保持多能性(Heynesworth S.E.，Goshima J.，Goldberg V.M.，Calplan A.I.Characterization of cells with osteogenic potential from the human bone marrow//Bone.1995.第13卷.第81-85页)。这种方法的缺点是搜索细胞培养的合适批次和胎牛血清的相应分析要花费大量时间且非常繁琐。此外，因为胎牛血清的批次与批次之间显示巨大变化，所以无法确保结果可以再现。

这种方法的另一个缺点是，为了获得足量的用于临床应用的间质干细胞，细胞必须培养4到6周，且在一些情况下，例如在患有骨代谢疾病的患者中，培养时间可能更长。之所以需要所述长培养时间的原因是，如先前所述，从骨髓获得的间质细胞的数量很少。

长细胞培养时间可能增加污染风险且显著增加培养物的维持成本。此外，由于复制数增加，因此细胞存在可能丧失多能性或进入衰老的风险，这会损害其治疗能力。

通常用于缩短间质细胞培养时间的方法的关注点集中在例如培养基的补充物、塑料表面的性质、接种剂量和所用培养方式等因素(Sotiropolou P.A.，Pérez  S.A.，Salagianni M，Baxevanis  C.N.，Papamichail M.Characterization of the optimal culture conditions for clinical scale production of human mesenchymal stem cells.Stem Cells 2006；24：462-471)。

发明内容