[发明专利]不含选择性标记的转质体植物

说明书

技术领域

本发明涉及不含选择性标记的转质体(transplstomic)植物、特别是豆科植物，涉及获得此类植物的方法和所用的载体和构建体。

背景技术

植物转基因包括向植物中导入来自不同生物体(细菌、病毒、昆虫、植物)的一种或多种基因，目的在于给植物提供新的特性，改善某些农学或食品品质。基因的极度多样性和传统遗传转化技术的发展已导致产生新的植物品种。在某些情况下，由于引入赋予了对除草剂、病原体或不同应激的耐性，有利于作物生产并提高产量。在其它情况下，可改善植物的营养价值和某些基础化合物的含量。

大量作物品种属于豆科植物家族，特别是产蛋白植物如豌豆、蚕豆、黄豆、鹰嘴豆、小扁豆，产油植物如大豆和花生，牧草如苜蓿或三叶草。赋予豆科植物农学价值的的基本性质是其高蛋白含量。这一性质使这些植物成为人们过量表达感兴趣的蛋白质的上选。

获得稳定的转基因植物有很多技术，包括将外源基因导入植物的核基因组。另一种获得转基因植物的方式是质体(plastid)的直接转化。具体而言，质体转化与核转化相比有许多优势，可提及的有：

-质体转化是通过双重同源重组将基因插入每个细胞内的一个或多个拷贝的环状质体基因组(或质体组plastome)中，优点为精确靶向质体组内需要整合感兴趣的基因的区域，避免核转基因中常见的“位置”效应；

-每个细胞可获得极大量拷贝的转基因。具体而言，叶细胞可包含多达10 000拷贝的质体组。然后，可操作植物细胞使其含有多达20 000拷贝的感兴趣基因。该特征导致高水平的表达；转基因的产物可能占总可溶蛋白质的40％以上(De Cosa等，2001)。

-质体转化的其它优势是极大限制了转基因环境散播的风险。由于质体编码的性状一般不能通过花粉传播，限制了转基因传播到野生物种的潜在风险。

最初在单细胞藻类莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)中用生物射弹进行质体转化(Boynton等，1988)，该方法现已延伸至烟草(Svab等，1990和1993)。

目前，高等植物的质体稳定转化已在烟草植物烟草(N.tabacum)中常规进行(Svab和Maliga，1990；Svab等，1993)。近年来对水稻(Khan 和Maligna，1999)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)(Sikdar等，1998)、马铃薯(Sidorov等，1999)、油菜(Chaudhuri等，1999)和番茄(Ruf等，2001)质体的转化取得了一些进展。多年来未能成功产生可繁殖的转质体大豆植物，直到公开了高频转化大豆质体产生可繁殖植株的新方法和新手段(WO 04/053133)。

McBride等1994年的文章、美国专利第5,451,513；5,545,817；5,545,818和5,576,198号，还有国际专利申请WO 95/16783和WO 97/32977中更详细描述了质体转化技术。

质体转化已用于获得良好水平的除草剂耐性或抗虫性、或者用于大量生产蛋白质。因此，烟草质体组的除草剂如草甘膦(Daniell，1998；WO99/10513；Ye等，2000；WO 01/04331，WO 01/04327)或草胺膦(Basta)(Lutz等，2001)的耐受基因过度表达产生了对这些除草剂出色的耐受性。其它应用导致产生对昆虫耐受或过量产生治疗性蛋白的转质体植物(McBride等，1995；美国专利5,451,513；Staub等(2000)；WO 99/10513)。

然而，如常规进行的高等植物质体的直接转化的一个主要缺点是采用抗生素抗性基因作为选择性标记。

通常用于选择转质体品系的选择性标记是细菌基因aadA，它在质体调控元件的控制下表达(Svab等，1993；Staub等，1993)。编码氨基糖苷3’-腺苷转移酶的aadA基因的表达产生两种抗生素抗性，即壮观霉素和链霉素抗性。aadA基因产物防止壮观霉素(或链霉素)结合于质体核糖体30S亚基的部件16S RNA(参与识别翻译起始密码子)，从而防止了抑制质体内的翻译。仅有含有表达aadA基因产物的质体的细胞能够继续在体外最优地生长并保持绿色。另一种选择性标记是具有点突变的16S RNA序列，该点突变使其对壮观霉素不敏感。

不幸的是，这种抗生素也控制人和动物中的细菌感染。因此，更希望最终产物中不含有该抗生素。因此，人们主要关心可以清除选择性标记基因，特别是抗生素标记基因，同时将感兴趣的基因保持在转基因植物中的方法。