[发明专利]使用二氧化碳控制肺炎链球菌多糖分子量的方法

说明书

发明领域

本发明涉及增加分离的在糖重复单元之间具有磷酸二酯键的肺炎链球菌荚膜多糖的分子量的方法。

背景

在制备预防由肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)(也称作肺炎球菌)生物体导致的侵袭性疾病的多价缀合的肺炎疫苗中，使选择的肺炎链球菌血清型生长以提供产生疫苗所需的多糖。细胞在发酵罐中生长，在发酵结束时通过加入脱氧胆酸钠或者另外的裂解剂诱导裂解。然后收获裂解物肉汤以进行下游的纯化及回收围绕细菌细胞的荚膜多糖。在与载体蛋白缀合后，所述多糖包含于最终的疫苗产物中，并赋予疫苗靶向群体对于选定的肺炎链球菌血清型的免疫力。

多糖大小是在每个批次制品中测定的质量属性，且必须适当控制。传统的处理方法在发酵期间使用NaOH(氢氧化钠)作为碱滴定剂。使用NaOH的优势在于能降低脱氧胆酸裂解物的pH而不形成泡沫，以便除去蛋白质和改良过滤。将这个材料进行离心，随后过滤以除去低至0.45μm额定尺寸(nominal size)的大多数固体。然而，对于糖重复单位之间具有磷酸二酯键的血清型(例如6A、6B、19A和19F)而言，这种传统处理方法产生的多糖分子量较低(＜450kDa)。

因此，需要从细胞肺炎链球菌裂解物中、特别是从含有肺炎链球菌血清型6A、6B、19A或者19F多糖的裂解物中回收高分子量荚膜多糖的改良的方法。

发明简述

本发明提供了从肺炎链球菌细胞裂解物中回收高分子量的荚膜多糖的改良的方法，所述裂解物含有在糖重复单元之间具有磷酸二酯键的血清型。在一种方法中，向糖重复单元之间含有磷酸二酯键的肺炎链球菌血清型的发酵培养物提供CO₂。因此，在本发明的一个实施方案中，所述方法包括如下步骤：1)制备肺炎链球菌细菌细胞的发酵培养物，其产生重复单元之间包含磷酸二酯键的荚膜多糖；2)向所述发酵培养物提供CO₂；3)裂解发酵培养物中的细菌细胞；以及4)从发酵培养物中分离肺炎链球菌荚膜多糖，其中产生含有高分子量的分离的肺炎链球菌荚膜多糖的溶液，多糖在重复单元之间含有磷酸二酯键。

在一具体的实施方案中，制备产生多糖血清型19A、6A、19F、6B及其组合的肺炎链球菌细菌细胞的发酵培养物。在另一具体的实施方案中，向发酵培养物提供CO₂包括在发酵培养物中加入碳酸氢根离子(HCO₃^-)，例如在发酵培养物中加入NaHCO₃(碳酸氢钠)。在进一步的实施方案中，向发酵培养物提供CO₂包括在发酵培养物中加入碳酸根离子(CO₃^2-)，例如在发酵培养物中加入Na₂CO₃(碳酸钠)。在另一实施方案中，向发酵培养物提供CO₂包括首先加入NaHCO₃其次加入Na₂CO₃。在另一个实施方案中，向发酵培养物提供CO₂包括用CO₂覆盖发酵培养物。在另一实施方案中，分离的肺炎链球菌荚膜多糖的分子量为至少700kDa。在另一实施方案中，提供了含有高分子量的分离的肺炎链球菌荚膜多糖的溶液，其中所述多糖在重复单元之间包含磷酸二酯键，其中所述溶液通过上文所述方法产生。

在本发明的另一实施方案中，提供了产生含有高分子量的分离的肺炎链球菌血清型19A荚膜多糖的溶液的方法。所述方法包括如下步骤：1)制备肺炎链球菌细菌细胞的发酵培养物，其产生血清型19A荚膜多糖；2)向所述发酵培养物提供CO₂；3)裂解所述发酵培养物中的细菌细胞；及4)从所述发酵培养物中分离肺炎链球菌血清型19A荚膜多糖；从而产生含有高分子量的分离的肺炎链球菌血清型19A荚膜多糖的溶液。在另一实施方案中，提供了含有高分子量的分离的肺炎链球菌血清型19A荚膜多糖的溶液，其中所述溶液通过上述方法产生。