[发明专利]含有糖化血红蛋白的试样的前处理方法

说明书

技术领域

本发明涉及糖化血红蛋白，特别涉及通过免疫学方法来正确测定糖化血红蛋白A1c的方法。

背景技术

血中的血红蛋白与糖结合的糖化血红蛋白(Glycohemoglobin)，特别是血红蛋白β链N末端的缬氨酸残基被糖化的血红蛋白A1c(以下称作“HbA1c”)，在临床上由于反映了过去1～2个月的平均血糖值，所以作为适于糖尿病诊断或糖尿病过程观察的指标而得到广泛的使用。

作为糖化血红蛋白的测定方法，已知的是HPLC法以及免疫学测定法，但是在免疫学测定法中，需要使用对血红蛋白的糖化部位具特异性的抗体。目前清楚的是，血红蛋白β链N末端的糖化部位并非存在于蛋白质的表面，而是包埋于蛋白质的内部，存在于抗体难于结合的地方。因而，为了使识别该表位(epitope)部位的抗体进行高效率的反应，开发出使该表位部位露出到表面的技术(专利文献1)。

作为使表位露出的方法，已知的是通过分别单独使用胍、硫氰酸、或者硫氰酸锂盐；或者通过使用硫氰酸与铁氰化物等氧化剂的组合、离子表面活性剂、非离子性表面活性剂等对含有糖化血红蛋白的试样进行处理的方法(专利文献1～6)。

专利文献

专利文献1：特开昭61-172064号公报

专利文献2：特开平01-155268号公报

专利文献3：特开平03-51759号公报

专利文献4：特开平06-11510号公报

专利文献5：特开2001-33442号公报

专利文献6：特开2007-163182号公报。

发明内容

然而，关于以往的表位露出化方法，例如，胍处理需要加热处理。硫氰酸是对环境有害的物质。铁氰化物等氧化剂具有容易着色等保存稳定性上的问题。非离子性表面活性剂单独用时存在效果并不充分等问题。

因此，本发明的课题在于提供含有糖化血红蛋白的试样的前处理方法以及使用该方法的糖化血红蛋白的免疫学测定法，其处理简便、在保存稳定性以及环境方面不存在问题，并且能够使表位在短时间内充分露出。

因此，本发明人在对于糖化血红蛋白的高效且简便的表位露出化方法进行了研究之后，发现如果用含有胍与非离子性表面活性剂和/或亚硝酸盐的溶液来处理含有糖化血红蛋白的试样，则与分别单独使用胍、非离子性表面活性剂以及亚硝酸盐的情况相比，可获得非常优异的表位露出化效果，即使不施加加热处理也可使糖化部分在短时间内高效地露出，使糖化血红蛋白的正确的免疫学测定成为可能，从而完成了本发明。

即，本发明提供了含有糖化血红蛋白的试样的前处理方法，用于免疫学测定糖化血红蛋白，其特征在于，用含有(A)胍或其盐、与(B)非离子性表面活性剂和/或亚硝酸盐的前处理液，对含有糖化血红蛋白的试样进行处理。

并且，本发明提供了含有糖化血红蛋白的试样的前处理液，用于免疫学测定糖化血红蛋白，其特征在于，含有(A)胍或其盐、与(B)非离子性表面活性剂和/或亚硝酸盐。

进一步，本发明还提供了含有糖化血红蛋白的试样中糖化血红蛋白的免疫学测定方法，其特征在于，将含有糖化血红蛋白的试样用含有(A)胍或其盐、与(B)非离子性表面活性剂和/或亚硝酸盐的前处理液进行处理，然后用抗糖化血红蛋白抗体进行免疫学测定。

根据本发明的前处理方法，通过短时间的简便处理，试样中的糖化血红蛋白中的糖化部分会高效率地露出。因此，如果使用该处理过的试样来进行使用抗糖化血红蛋白抗体的免疫学测定，则使正确地定量糖化血红蛋白成为可能。

附图说明

图1表示用竞争ELISA法对各试剂的表位露出化效果进行比较的结果。

图2表示用竞争ELISA法对本发明试剂的表位露出化效果中pH的影响进行研究的结果。

图3表示用竞争ELISA法对本发明试剂的保存稳定性进行研究的结果。

图4表示根据使用本发明试剂的夹层ELISA进行的HbA1c浓度测定系以及HbA0浓度测定系中的校正曲线。

图5表示根据免疫色谱法进行的HbA1c的测定方法的概略图。

具体实施方式

本发明的含有糖化血红蛋白的试样为糖化血红蛋白测定用的被检试样，可举出例如血液、红血球成分等。在此，作为糖化血红蛋白，优选血红蛋白β链被糖化的糖化血红蛋白，特别优选HbA1c。

此外，利用本发明方法而露出的表位部位为血红蛋白的糖化区域，例如血红蛋白β链的糖化N末端区域，更优选含有血红蛋白β链的N末端缬氨酸被糖化的肽的区域。