[发明专利]LCMV-GP-VSV假型载体和肿瘤浸润性的病毒生产细胞用于肿瘤的治疗

说明书

本发明涉及衍生自水泡性口炎病毒(VSV)的重组病毒和病毒载体其包含编码淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)的糖蛋白GP的基因，涉及产生GP-LCMV-假型化VSV病毒粒子的包装细胞，并涉及所述病毒粒子和包装细胞用于制备用于治疗实体肿瘤的药物组合物的用途。

背景技术

恶性神经胶质瘤(原生颅内脑瘤的最大的组)代表至今未解决的治疗问题。虽然通过高强度的基础研究，对此类肿瘤的生物学的理解已增长，临床过程和预后仍然很差。

恶性神经胶质瘤是神经上皮起源的肿瘤并且在细胞学上被划分为室管膜瘤、少突神经胶质瘤、寡星状细胞瘤、星状细胞瘤和胶质母细胞瘤。弥漫浸润性星状细胞瘤(WHO级别II-IV)具有超过60％的比例，组成了颅内肿瘤的最大的组。于2001年修订的WHO分类被最广泛地作为星状细胞瘤的分级方案。根据WHO，介由组织学标准将脑瘤分为4种恶性级别(Kleihues和Cavenee，2000)。弥漫浸润性星状细胞瘤的预后通常不良。预后一方面取决于恶性级别，另一方面取决于肿瘤的位置和治疗方法。对于具有星状细胞瘤WHO级别II的患者，平均存活时间多于5年；对于具有星状细胞瘤WHO级别III的患者，平均存活时间为2-5年；而对于具有WHO级别IV的星状细胞瘤-胶质母细胞瘤(＝胶质母细胞瘤)的患者，平均存活时间少于1年。

肿瘤的分子学发病机理是复杂的过程并且是由于负责控制细胞周期的不同基因的突变而产生的。肿瘤抑制因子基因p53中的突变是人类肿瘤中最常发现的改变并且既负责低级别星状细胞瘤的出现也负责向继发性胶质母细胞瘤的发展。原发出现的胶质母细胞瘤反而很罕见地具有p53突变。另一个指示弥散性星状细胞瘤的恶性趋势的基因被怀疑在染色体19的长臂上。在胶质母细胞瘤的情形中其他经常被改变的基因是致癌基因MDM2和MDM4以及肿瘤抑制因子基因p14ARF，在细胞周期的p53依赖性控制中涉及它们(Dai和Holland，2001)。在30-40％的原发性胶质母细胞瘤中观察到了EGF受体基因的扩增，因此其是此肿瘤组中最常被扩增的致癌基因(Holland，2001)。大多数恶性神经胶质瘤对化学或放射疗法的响应不良。其原因被怀疑是细胞周期相关基因的突变，所述基因也参与细胞凋亡的调控。

因为从现存的治疗方法(例如化学或放射疗法)不再期待疾病预后的显著改善，亟需用于恶性神经胶质瘤的更有效的治疗方法。而胶质母细胞瘤的基因治疗提供了有希望的可能性，所述可能性需被开发。为此目的，已开发了多个不同的、非常有效的基因。对于其中的大多数，也存在动物实验的数据(Shir和Levitzki，2001)。这些治疗性基因可被划分为四种不同的作用原理：

(i)所谓自杀基因的基因产物将前体物质转化为细胞毒性分子。实例是单纯疱疹病毒(HSV)的胸苷激酶(TK)，与更昔洛韦的给药相结合。特别的优势是有毒的更昔洛韦三磷酸盐扩散到临近的细胞中，从而产生“旁观者(bystander)”效应。近年来，此酶的所述活性被进一步提高了。目前HSV TK是清除肿瘤细胞以及植入的载体产生细胞的很有效的可能性。

(ii)免疫刺激性细胞因子(例如IL-4)在肿瘤中的表达可刺激抗肿瘤细胞的天然防御。

(iii)抗血管生成蛋白(例如内皮他丁)的分泌引起血管的缺少，并因此引起代谢上非常活跃的肿瘤组织中营养供给的缺少。肿瘤实际上在经受饥饿。

(iv)最后，描述了一系列基因，其参与肿瘤细胞的细胞周期或信号转导从而抑制所述细胞的不受控生长。然而，这些基因在临床中的应用可能性是受限的，因为这些基因仅在经基因修饰的细胞自身中起作用，而不产生如所述第一个作用原理的“旁观者”效应。这意味着为了实现治疗效果，实际上所有的恶性细胞均需经过遗传修饰，而即使使用理想的载体系统，这也是没有希望的。

多个现存的、非常有效的作用原理产生了对于胶质母细胞瘤的成功的基因治疗而言最重要的前提条件。然而，至此仍未解决的问题是至今低效的基因转移和治疗性基因在靶细胞中的不良表达。这也是为什么尽管有许多有效的治疗性基因，胶质母细胞瘤的基因治疗仍在临床中失败。

病毒的基因转移相比于物理化学转染方法的优势是更高的基因转移率和基因的更长期表达，因为病毒发展了特别有效的机制来将其基因组引入细胞中并进行表达。作为溶瘤病毒(OV)，目前特别使用的是能够复制的病毒，例如单纯疱疹病毒(HSV)、腺病毒(Ad)、新城疫病毒(NDV)、呼肠病毒和水泡性口炎病毒(VSV)。对于胶质母细胞瘤的最佳病毒治疗而言，OV应具有下列特征：