[发明专利]2-羟基异丁酸(2-HIBA)的酶法产生

权利要求书

1.一种用于制备2-羟基异丁酸(2-HIBA)的方法，包括使得乙酰CoA能够转化为2-羟基异丁酸的连续步骤，所述连续步骤由下述组成：

a)将乙酰CoA转化为3-羟基丁酰CoA，

b)将之前获得的3-羟基丁酰CoA转化为2-羟基异丁酰CoA，和

c)将2-羟基异丁酰CoA转化为2-羟基异丁酸，

其中步骤a)、b)和c)是酶法转化。

2.权利要求1的方法，其中步骤a)中的酶活性是通过两种酶的组合获得的，

-第一酶a1)，具有乙酰乙酰CoA硫解酶或乙酰CoA乙酰转移酶活性，和

-第二酶a2)，具有3-羟基丁酰CoA脱氢酶活性。

3.权利要求2的方法，其中酶a1)是由选自下组的基因编码的基因产物：大肠杆菌(E.coli)的atoB，丙酮丁醇梭菌(C.acetobutylicum)的thlA和真养雷尔氏菌(R.eutropha)的phaA。

4.权利要求2或3的方法，其中酶a2)是由选自下组的基因编码的基因产物：丙酮丁醇梭菌的hbd和真养雷尔氏菌的phaB。

5.权利要求1-4任一项所述的方法，其中步骤b)是用具有羟基异丁酰CoA变位酶活性的酶系统获得的。

6.权利要求5的方法，其中所述羟基异丁酰CoA变位酶活性是通过由如下基因编码的基因产物得到的酶来实施的：来自A.tertiaricarbonis、M.petroleiphilum或链霉菌属菌种的icmA和icmB。

7.权利要求6的方法，其中羟基异丁酰CoA变位酶的活性通过过表达fldA-fpr激活系统来增加。

8.权利要求1-7任一项所述的方法，其中步骤c)是通过用具有CoA转移酶活性的酶将CoA转移至底物上来获得的。

9.权利要求8的方法，其中所述酶具有乙酰CoA转移酶活性，而所述底物为乙酸和2-羟基异丁酰CoA。

10.权利要求1-7任一项所述的方法，其中步骤c)是通过用具有酰基CoA硫酯酶活性的酶将CoA转移至底物上来获得的。

11.权利要求10的方法，其中所述酰基CoA硫酯酶活性是通过由选自下组的基因编码的基因产物得到的酶实施的：大肠杆菌的tesB和流感嗜血杆菌(H.influenzae)的ybgC。

12.权利要求1-7任一项所述的方法，其中步骤c)是通过两种酶的组合获得的：

-第一酶c1)，具有磷酸转酰基酶活性，和

-第二酶c2)，具有酸激酶活性。

13.权利要求12的方法，其中酶c1)具有磷酸羟基异丁酰转移酶活性，特别是由丙酮丁醇梭菌的基因ptb编码的基因产物。

14.权利要求12或13任一项的方法，其中酶c2)是羟基异丁酸激酶，特别是由丙酮丁醇梭菌的基因buk编码的基因产物。

15.权利要求1-14任一项所述的方法，其中乙酰CoA是通过在微生物中生物转化碳源来获得的。

16.权利要求1-15任一项所述的方法，其中步骤a)、b)和c)由表达具有所述步骤a)、b)和c)的转化所需的酶活性的酶的编码基因的微生物来实施。

17.权利要求1-16任一项所述的方法，其中步骤a)、b)和c)由同一微生物来实施。

18.权利要求17的方法，其中所述同一微生物提供葡萄糖至乙酰CoA的生物转化。

19.一种微生物，其经修饰用于改进2-羟基异丁酸的产生，其中所述微生物表达具有权利要求2-15中限定的所述步骤a)、b)和c)的转化所需的酶活性的酶的编码基因。

20.权利要求17的微生物，其中其经修饰而产生更高水平的乙酰CoA。

21.权利要求18的微生物，其中减弱了至少一种下述基因的表达：

·pta，其编码磷酸转乙酰酶

·ackA，其编码乙酸激酶

·poxB，其编码丙酮酸氧化酶

·ldhA，其编码乳酸脱氢酶

·aceA，其编码异柠檬酸裂合酶。