[发明专利]用于数字PCR的方法

说明书

相关申请

本发明要求2008年8月12日提交的美国临时申请号61/088,142的优先权，该申请的内容通过引用并入。

技术领域

本发明涉及用于进行核酸扩增反应包括聚合酶链式反应(PCR)的方法和设备。

背景技术

PCR是在医学和生物研究领域常规使用的分子扩增方法，其用于多种任务，例如检测遗传性疾病、鉴定遗传指纹、诊断传染性疾病、克隆基因、亲子鉴定和其它类型的核酸分析。关于PCR方法的综述，参见例如PCR Protocols(Methods in Molecular Biology)，Barlett andStirling(编)，Humana Press(2003)；和PCR，McPherson and Moller，Taylor & Francis(2006)。

数字PCR是允许扩增来自最小稀释的样品的单一DNA模板的技术，因此，其产生专有性地来源于一个模板的扩增子，所述扩增子可以通过使用不同的荧光团进行检测并且可以被测序以区分不同的等位基因(例如野生型相对于突变体，或者，父本的相对于母本的等位基因)。关于数字PCR方法的综述，参见例如Pohl等人，Expert Rev.Mol.Diagn.，4(1)：41-7(2004)。该技术的基本前提是将大的样品分成数个较小的亚体积(分割的体积)，其中所述亚体积平均包含单一拷贝的靶标。然后，通过计数所述亚体积中的阳性数目，人们可以推导出起始体积中的靶标的起始拷贝数。最常见的是使用多个连续稀释的起始样品以获得亚体积中的适当浓度，通常通过给定的PCR设备测定亚体积的体积。这个另外的步骤增加了要处理的样品的数目。可以测定在统计上代表整个样品的一组亚体积，以减少该数目。但是，在某些状况下，可能需要检测表达程度非常低的基因，导致产生大量的空白的分割的体积，因此，要评估大量的亚体积。虽然在这种情况下使样品更加浓缩是可能的，但是这样做可能引入显著的可变性和损失(参见，例如N.Blow，NatureMethods，4：869-875(2007))。此外，更加浓缩的样品意味着起始时需要更多的样品。

进一步的考虑提示减小扩增反应的体积可能改善检测单一分子的灵敏性。例如，测定法需要接近饱和的量的PCR扩增产物以检测荧光。PCR反应通常在大约10¹¹个产物分子/微升时达到饱和，这部分是由于产物链的重新退火。为了在10μl中在30个循环后达到这样的产物浓度，PCR需要至少10³个起始模板分子。如果PCR的体积减少至～10纳升，则单个分子可以产生被测定法检测的所需要的产物。已经尝试使PCR的体积小型化(综述参见例如Zhang等人，Nucl.Acids Res.，35(13)：4223-4237(2007))。但是，随着样品体积的减小，由于逐渐增大的表体比和潜在的其它可变性来源，扩增会更有可能产生生物化学表面吸附的问题。

因此，需要精确测定或定量靶标拷贝数的方法和设备，包括通过数字PCR的方式进行。

发明内容

本发明提供了进行核酸反应的方法，包括通过使用“油包液滴”(droplet-in-oil)技术进行数字PCR的方法，其中样品被分割成液滴，所述液滴置于通过微流通道的载液的持续流中。此类技术的一个实例描述于PCT专利申请公开号WO 2007/091228(对应美国系列号12/092,261)、WO 2007/091230(USSN 12/093,132)和WO 2008/038259以及实施例中。在被称为“持续流PCR”的这些系统中的一些之中，液滴在整个反应和检测过程中被完全包裹在载液中。本发明至少部分基于实现了10-500nl的样品滴提供了通过PCR分析低度表达的靶标的优势。以下描述了本发明的各个方面。

在一些实施方式中，方法包括：

a)提供包含待测靶核酸的起始样品；

b)分割至少一部分样品以提供在通过通道(例如毛细管)的不混溶载液(例如油)的持续流中的一组样品液滴，每一个所述液滴平均包含大约1个或更少的拷贝的靶核酸和足以进行聚合酶链式反应的试剂；

c)使所述液滴通过多个热区(thermal zone)，从而允许靶核酸，如果存在的话，在每个液滴中被扩增；和

d)检测所述流中的液滴中的扩增的靶核酸的存在或不存在，和/或测定其数量。