[发明专利]突变的Δ5去饱和酶及其在制备多不饱和脂肪酸中的用途

说明书

本专利申请要求2008年9月19日提交的美国临时申请61/098333的权益，其公开内容全文以引用方式并入本文。

发明领域

本发明属于生物技术领域。更具体地讲，本发明与编码突变Δ5脂肪酸去饱和酶(其中在细胞色素b₅-样结构域的HPGG基序发生至少一个突变)的核酸片段的构建和这些去饱和酶在长链多不饱和脂肪酸[“PUFA”]的制备中的使用有关。

背景技术

包括植物、藻类、真菌、原生藻菌(stramenopiles)和酵母在内的多种不同宿主正作为商业化多不饱和脂肪酸[“PUFA”]生产的手段被研究。基因工程已经证明，一些宿主(即使是亚油酸[LA；18:2ω-6]和α-亚麻酸[ALA；18:3ω-3]脂肪酸生产天然地受限的那些)的天然能力能够被基本上改造以实现多种长链ω-3/ω-6 PUFA的高水平生产。花生四烯酸[ARA；20:4ω-6]、二十碳五烯酸[EPA；20:5ω-3]和二十二碳六烯酸[DHA；22:6ω-3]的生产可能都需要Δ5去饱和酶的表达，无论这是天然能力还是重组技术的结果。

迄今鉴定的大多数Δ5去饱和酶具有将二高-γ-亚麻酸[DGLA；20:3ω-6]转化为ARA的主要活性，和将二十碳四烯酸[ETA；20:4ω-3]转化为EPA的次要活性。在公开文献和专利文献中均已公开了多种Δ5去饱和酶。基于去饱和酶的进化，P.Sperling等人(Prostaglandins Leukot.Essent.Fatty Acids，68：73-95(2003)对Δ5去饱和酶的一般特性作了很好的描述。连同Δ6、Δ8和Δ4去饱和酶一起，已知Δ5去饱和酶是长链PUFA“前端”去饱和酶(其中去饱和发生在业已存在的双键和脂肪酸酰基的羧基末端之间，与甲基定向的去饱和相反)。这些去饱和酶的特征在于三个组氨酸框[H(X)_3-4H(SEQ ID NO：1和2)、H(X)_2-3HH(SEQ ID NO：3和4)和H/Q(X)_2-3HH(SEQ ID NO：5和6)]，并且是细胞色素b₅融合超家族的成员，因为它们在N末端具有融合的细胞色素b₅结构域，该的细胞色素b₅结构域，该结构域起到电子供体的作用。所述细胞色素b₅结构域还包含保守的血红素结合基序(即，组氨酸-脯氨酸-甘氨酸-甘氨酸序列或者叫“HPGG”[SEQ ID NO：180]序列)，尽管其余的细胞色素b₅结构域序列有差异。这些基序序列是美国专利5,972,664的主题。

一些研究已表明HPGG基序与酶活性有关。Sayanova，O.等人(Plant Physiol.，121：641(1999))进行了定点诱变以在琉璃苣的Δ6去饱和酶中用丙氨酸残基取代HPGG基序的组氨酸残基。在拟南芥中表达了突变酶；然而却未能检测到酶活性，表明去饱和酶的细胞色素b₅结构域对于功能是重要的。在大鼠Δ6去饱和酶中进行了类似的研究，其中在HPGG基序中进行了丙氨酸对组氨酸的取代。突变蛋白质同样不具有活性(Guillou，H.，等人，J.Lipid Res.，45：32-40(2004))。最近，Hongsthong，A.等人(Appl.Microbiol.Biotechnol.，72：1192-1201(2006))报告了在螺旋藻(Spirulina)的Δ6去饱和酶中，用丙氨酸残基对HPGG基序的组氨酸残基的取代。与之前的报道一样，突变使得突变酶不能在大肠杆菌中产生GLA，表明细胞色素b₅结构域对于活性是重要的并且该基序的改变将导致酶活性的降低。尽管Δ5去饱和酶相对普通并且已被很好地描述，但依然存在对在能制造PUFA的生产宿主细胞中以高水平有效表达的酶的需求。

因此，有待解决的问题是发现适合在商业上有用的宿主细胞中整合到PUFA生物合成途径的、具有高活性的新的Δ5去饱和酶。通过意料之外的发现，即在多种Δ5去饱和酶的细胞色素b₅结构域的HPGG基序中的改变，导致了以DGLA向ARA的转化计最高38％的酶活性升高，申请人已解决了上述问题。

发明概述

本发明涉及编码具有Δ5去饱和酶活性的多肽的新的遗传构建体，以及它们在细菌、酵母、藻类、眼虫、原生藻菌(stramenopiles)、卵菌和真菌中用于生产PUFA的使用。