[发明专利]环巴胺的分离

说明书

相关申请

本申请要求于2008年7月2日提交的美国临时专利申请61/077,703的优先权，将其全文引入作为参考。

背景

二十世纪50年代中期，在爱达荷中部报告了重度畸形的单眼羔羊的出生。美国农业部和FDA，历经11年的研究，确定由怀孕的母羊在妊娠第14天母源摄入野生藜芦(corn lily)加州藜芦(Veratrum californicum)诱导了羔羊的这种独眼型(cyclopian-type)畸形。加州藜芦生长在海拔高度为5,000-11,000英尺之间的美国西部的开阔的亚高山草甸和山坡上。加州藜芦中诱导独眼型畸形的主要致畸化合物随后被分离出来，并被鉴定为11-去氧介芬胺，称之为“环巴胺(cyclopamine)”。环巴胺作为刺猬(hedgehog)(Hh)通路抑制剂，阻断胚胎发育所必需的音猬(Sonic hedgehog)基因的功能(Cooper等人，Science(1998)280：1603-1607；Chen等人，Genes andDevelopment(2002)16：2743-2748；Incardona等人，Dev.Biol.(2000)224：440；和Chen等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2002)99：14071)。在加州藜芦中可能存在的其它藜芦生物碱包括但不限于cycloposine、藜芦胺、藜芦新碱、介芬胺和muldamine。

尽管环巴胺具有致畸性质，但其为有效的抗癌剂。在使用环巴胺的研究中，研究者已使最致命的人肿瘤停止生长，各种形式的最致命的人肿瘤导致了25％的癌症死亡。目前正在研究将环巴胺和环巴胺类似物作为一些不同癌症(例如基底细胞癌、髓母细胞瘤、横纹肌肉瘤、肺癌、胰腺癌、乳腺癌、胶质母细胞瘤)的治疗剂和作为多发性骨髓瘤的治疗剂。

数年前由Keeler及其同事们(Keeler，Phytochemistry(1968)7：303-306)描述了从加州藜芦中分离环巴胺的方法，但该方法从千克量级的干燥植物材料中仅能得到毫克量级的环巴胺。因此，继续需要新的和改进的环巴胺分离方法。

概述

显著量的藜芦生物碱作为糖基化衍生物贮存在加州藜芦中。本发明提供了新的去糖基化方法，该方法设计用来优化得自藜芦属植物材料和/或藜芦属植物材料的提取物的去糖基化藜芦生物碱的收率。

例如，提供了从藜芦属植物材料中分离去糖基化藜芦生物碱的方法，该方法包括下列步骤：

(i)提供包含糖基化藜芦生物碱的藜芦属植物材料；

(ii)使藜芦属植物材料与水溶液接触；和

(iii)用溶剂提取藜芦属植物材料以提供包含去糖基化藜芦生物碱的提取物。

还提供了去糖基化方法，该方法包括使糖基化的藜芦生物碱与酶在缓冲溶液中接触以提供去糖基化的藜芦生物碱。

附图简述

图1描述了cycloposine(CS)、环巴胺(CA)、藜芦新碱(VS)和藜芦胺(VA)的化学结构。

图2描述了在加州藜芦的不同生物质(biomass)样品中存在的环巴胺的量(以g/kg计)。

图3描述了在加州藜芦的不同生物质样品中存在的环巴胺(CA)和cycloposine(CS)的量(以g/kg计)。

图4描述了通过液相色谱-质谱法(LCMS)监测，使用β-葡糖醛酸糖苷酶(盖罩大蜗牛(Helix pomatia))在醋酸盐缓冲液(pH 5.1)中纯化的cycloposine经由去糖基化向环巴胺的酶转化。

图5描述了比较使用β-葡糖醛酸糖苷酶(盖罩大蜗牛)在醋酸盐缓冲液(pH 5.1)和Tris缓冲液(pH 7.2)中将纯化的cycloposine经酶转化成环巴胺的效率的HPLC描迹图。

图6描述了表明相应于在用β-葡糖醛酸糖苷酶(盖罩大蜗牛)处理的粗藜芦属提取物中的cycloposine、藜芦新碱、环巴胺和藜芦胺的峰的LCMS描迹图。

图7描述了酶浓度对cycloposine向环巴胺转化的影响。

图8描述了当先用水处理，接着用MeOH提取时粗藜芦属提取物中糖基化生物碱的转化。

图9描述了从各种生物质样品中cycloposine向环巴胺的转化。

图10描述了当用MeOH或50％MeOH的水溶液处理和提取时粗藜芦属提取物中糖基化生物碱的转化。

图11比较在各种条件下处理生物质的结果：(i)用50％MeOH的水溶液处理，接着如图10中所述的那样提取；(ii)用100％MeOH处理，接着如图10中所述的那样提取；和(iii)用水处理，接着用MeOH提取，如图8中所述。