[发明专利]新型蛋白酶及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及新型蛋白酶及其应用，详细而言，涉及在高温且高碱性条件下具有高活性的新型蛋白酶及其前体、编码它们的多核苷酸以及它们的应用。

背景技术

蛋白酶是催化肽键水解的酶的总称，在微生物、动物和植物中广泛分布。另外，蛋白酶是在洗涤剂、皮革加工、食品加工、功能性肽生产中广泛使用的代表性的工业用酶。尤其是从预防医疗器具的二次感染的观点出发，利用蛋白酶分解感染性蛋白质污垢正在成为难以替代的技术。在作为工业用酶的实用方面最受到重视的是酶的稳定性和其在使用条件下的活性的高低。尤其是很多情况下要求在物理、化学上具有较高的热稳定性，因此工业用蛋白酶广泛使用耐热性蛋白酶。目前，作为工业用蛋白酶，已知枯草杆菌蛋白酶(subtilisin carlsberg)、蛋白酶K等枯草杆菌蛋白酶家族蛋白酶(subtilisin family protease)。其中，美国Genencore公司出售的Prionzyme，作为在已实用化的蛋白酶中显示出最高稳定性的酶被用于器具清洗用途，以预防作为CJD(克雅氏病)等朊病毒病的病原体的异常型朊病毒的感染。但是，其最适作用条件为40～60℃、pH8～10，因而期望能够在更高温度下使用的蛋白酶的实用化。因此，为了发现能够在高温且高碱性条件下使用的新型蛋白酶，进行了大量的尝试。

例如，本发明人发现了一种蛋白酶(以下称为“Tk-枯草杆菌蛋白酶”(Tk-subtilisin))，其属于来源于超嗜热菌之一的Thermococcuskodakaraensis KOD1株的枯草杆菌蛋白酶家族，并且报道了Tk-枯草杆菌蛋白酶在pH9.5、温度80℃～100℃的条件下显示出最高的活性，以及在公知的蛋白酶中具有最高的热稳定性(参见非专利文献1和2)。另外，专利文献1中公开了同样来源于Thermococcus kodakaraensis KOD1株的耐热性蛋白酶，并且记载了以下内容：该耐热性蛋白酶的最适温度在80℃附近，对于耐热性，在120分钟的孵育后，在70℃下确认到约75％的残存活性，在80℃下确认到约50％的残存活性，对于耐碱性，在120分钟的孵育后，在pH11的条件下确认到90％以上的残存活性，在pH11.5的条件下确认到约85％的残存活性。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开2007-6846号公报

非专利文献

非专利文献1：Kannan，Y.，Koga，Y.，Inoue，Y.，Haruki，M.，Takagi，M.，Imanaka，T.et al.Active subtilisin-like protease from ahyperthermophilic archaeon in a form with a putative prosequence.Appl.Environ.Microbiol.67，2445-2552.(2001).

非专利文献2：Pulido，M.，Saito，K.，Tanaka，S.，Koga，Y.，Takano，K.& Kanaya，S.Ca²⁺-dependent maturation of Tksubtilisin from ahyperthermophilic archaeon：propeptide is a potent inhibitor of the maturedomain but is not required for its folding.Appl.Environ.Microbiol.72，4154-4162.(2006).

发明内容

虽然发现了上述非专利文献1和2中记载的蛋白酶或专利文献1中记载的耐热性蛋白酶那样能够在高温且高碱性条件下使用的新型蛋白酶，但它们尚未达到实用化的程度。另外，在很多情况下，工业用蛋白酶是添加到洗涤剂中而使用的，因而要求其在表面活性剂的存在下也稳定，并且能够发挥活性。因此，进一步发现新型蛋白酶并明确其功能、从而使其作为工业用蛋白酶实用化的研究和开发成为目前该技术领域的重大课题。

因此，本发明的目的在于提供一种新型蛋白酶，其在高温且高碱性条件下具有高活性，对于蛋白变性剂、表面活性剂的稳定性高，作为洗涤剂用蛋白酶非常有用。

本发明为了解决上述课题，包含以下发明。

[1]一种蛋白酶，其由以下(a)～(d)中任一项所述的氨基酸序列构成：

(a)序列号1所示的氨基酸序列；

(b)在序列号1所示的氨基酸序列中缺失、取代或添加一个或多个氨基酸而得到的氨基酸序列；