[发明专利]使哺乳动物祖细胞分化为产生胰岛素的胰岛细胞的方法

说明书

相关申请的交叉引用

本申请要求2008年5月22日提交的美国临时申请号61/055,341的优先权，其全部公开内容在此通过引用并入。

技术领域

本发明一般涉及特定细胞类型的哺乳动物祖细胞分化成另一种细胞类型。更具体说，本发明涉及使包括干细胞在内的哺乳动物祖细胞分化为产生胰岛素的胰岛细胞的方法。

背景技术

糖尿病(“糖尿病”)是美国发病率和死亡率的主要原因之一。罹患糖尿病的患者具有代谢紊乱和异常升高的血糖水平(即，高血糖症)，这是低水平的胰岛素生成所导致的。

胰腺朗格汉斯岛中存在的β细胞(“胰岛β细胞)产生胰岛素。在I型和(较小程度上)II型糖尿病中，胰岛素生成缺陷可以归因于功能性的产生胰岛素的胰岛细胞的量不足。该细胞损失的原因可能是病毒性、化学性和/或自体免疫性的攻击和破坏所述细胞。

考虑到该病因学，已经试图通过用供体胰腺细胞补充损失或损伤的细胞来逆转或预防糖尿病的发生。虽然已经显示这种基于细胞的疗法是有前景的，但是为了研究和/或移植，胰腺细胞、特别是人胰腺细胞的供应在数量和质量两方面而言都处于长期的供不应求。本发明提供了改善此供不应求的方法，部分地通过能够利用来自包括非胰腺组织的任何组织的祖细胞来得到产生胰岛素的胰腺细胞。

发明内容

本发明提供了使祖细胞分化为产生胰岛素的胰腺细胞的方法，该方法包括：(a)在包含2mmol/L丁酸钠的无血清预诱导培养基中孵育祖细胞；和随后，(b)在包含敲除替代血清(knock-out replacement serum)的诱导培养基中孵育祖细胞；持续足以使祖细胞分化为产生胰岛素的胰腺细胞的时间。祖细胞可以是肝干细胞、脐带基质干细胞或脂肪干细胞。优选地，祖细胞衍生自人组织。诱导培养基还可包含约2％敲除替代血清。

本发明另一个实施方案提供了体外评估化合物毒性的方法，包括使根据本发明从祖细胞分化的胰腺β胰岛样细胞与所述化合物接触；和测量所述胰腺β胰岛样细胞的存活力，其中与所述化合物不存在时的存活力相比，在所述化合物存在时的存活力下降，表明所述化合物在体内是毒性的。

本发明的另一个实施方案提供了在体外评估化合物活性的方法，包括使根据本发明从祖细胞分化的代谢活性胰腺β胰岛样细胞与所述化合物接触；和测量所述胰腺β胰岛样细胞的代谢活性，其中与所述化合物不存在时的代谢活性相比，在所述化合物存在时的代谢活性降低或提高，表明所述化合物在体内具有活性。

本发明进一步实施方案提供了用于治疗有相应需要的个体中胰腺β胰岛细胞的损失或耗竭的方法，包括向所述个体施用根据本发明从脐带基质细胞分化的胰腺β胰岛样细胞群。患者可能被诊断为具有糖尿病。

本发明的进一步实施方案提供了药物筛选试剂盒，包括一组本发明的胰腺β胰岛样细胞和至少一种用于测量胰岛素生成和/或基因表达的试剂。在一个实施方案中，所述试剂盒包括至少一种用于培养祖细胞衍生的胰腺β胰岛样细胞的培养基。

附图说明

图1提供了根据本发明取自被分化为胰腺β胰岛样细胞的人肝干细胞的cDNA的PCR分析结果。泳道1(Pdx)、泳道2(胰岛素)、泳道3(胰高血糖素)、泳道4(促生长素抑制素)、泳道5(glut2)、泳道6(GADPH，对照)。

图2显示了从根据本发明被分化为胰腺β胰岛样细胞的人UCM细胞的胰岛素生成的免疫组织化学染色。棕色(黑色)染色表明胰岛素的存在(10X放大)。

图3提供了根据本发明被分化为胰腺β胰岛样细胞的人UCM细胞的cDNA的PCR分析结果。从左到右：泳道1-Pdx-1；泳道2-胰高血糖素；泳道3-胰岛素；泳道4-glut 2；泳道5-促生长素抑制素；泳道6-GAPDH(对照)。

图4是显示根据本发明分化为胰腺β胰岛样细胞的人UCM细胞分泌到培养基中的胰岛素的量(第5天)的图。NSB：非特异性结合(对照)。

具体实施方式

本发明提供了将胰腺组织或非胰腺组织的祖细胞分化为产生胰岛素的胰腺细胞的方法。通过使用本发明的教导，任何组织的祖细胞，包括脂肪祖细胞、肝祖细胞和脐带基质祖细胞，可以被诱导分化为产生胰岛素的胰腺细胞。

术语“祖”细胞在本文概括地用于定义具有分化为更“成熟”细胞的能力的任何细胞。因此，术语“分化”不仅指单一细胞类型/谱系内的细胞“成熟”(例如，肝干细胞至成肝细胞)，但是可选地，还指细胞从一个类型/谱系“转化”为另一个类型/谱系(例如，肝细胞至胰腺细胞)。