[发明专利]由人多能干细胞制备人皮肤替代品的方法

说明书

技术领域

本发明涉及用于获得由人多能干细胞衍生的人角质形成细胞群的体外方法和制备人皮肤替代品的方法。

背景技术

皮肤由形成分化细胞功能单元的自我更新层组成，所述分化细胞起源于增殖的角质形成细胞的单一基层。构成角质层的死细胞和垂死细胞在脱屑过程中连续脱落，并被由生发层中的表皮干细胞衍生的细胞替代。表皮功能的丧失导致热调节的丧失、微生物防御性降低、干燥的风险、伤口修复被抑制以及美容的问题。在缺少用于皮肤移植的充足自体同源供体的情况下，用培养的人角质形成细胞覆盖伤口代表着有希望的治疗选择。

而且，人皮肤的体外和体内模型可以作为用于研究表皮细胞系或用于测试美容和药物化合物的治疗或毒性效应的极佳工具。例如对于体外模型的需要通过以下事实得到加强：存在着提供替代使用动物测试化合物和制剂的替代方式的动机。

另外，许多疾病影响角质形成细胞的功能，或者细胞自发地发挥作用或通过改变其形成多分层表皮组织的能力。人皮肤的体内和体外模型可以作为揭示疾病的分子机制并因此识别具有治疗潜力的药学或生物学化合物的途径。

因此，需要一种获得人角质形成细胞群的方法，该细胞群随后可以用于皮肤治疗或用于获得人皮肤的体外和体内模型。

胚胎干细胞和遗传学上重编程以复制胚胎干细胞(例如，称为“iPS”细胞的那些，其代表“诱导的多能干”细胞)的全部特征的体细胞是具有广泛增殖能力并因此提供用于研究和医药上的巨大潜在用途的多能干细胞。因此现有技术中已记载有一些用于从多能干细胞获得人角质形成细胞的尝试。例如，文献WO 02/097068描述了一种用于诱导胚胎干细胞的角质形成细胞分化的方法。进一步的研究报告了利用胚胎干细胞获得人角质形成细胞群(Coraux C.等人，2003；Ji L.等人，2006；Metallo CM.等人，2007以及Aberdam E.等人，2008)。然而，迄今为止，现有技术的方法没有获得由人多能干细胞衍生的人角质形成细胞，其在按照使用来自供体的成人基底角质形成细胞时显示出有效的技术(例如参见Green，2008)处理时表现出形成多分层表皮(在体外或在动物异种皮移植后)的能力。

发明内容

本发明涉及用于获得由人多能干细胞衍生的人角质形成细胞群的体外方法，包括如下步骤：在刺激表皮诱导的物质和刺激角质形成细胞的终末分化的物质存在下共培养人多能干细胞和支持外胚层分化的细胞。

本发明也涉及用于获得由人多能干细胞衍生的人角质形成细胞群的体外方法，所述方法包括如下步骤：在补充有BMP-4和抗坏血酸的角质形成细胞培养基的存在下，在涂有一层饲养层成纤维细胞的细胞培养表面上培养人多能干细胞。

本发明还涉及通过上述方法可获得的由人多能干细胞衍生的分离的基本上纯的同源人角质形成细胞群。

本发明还涉及含有本发明的由人多能干细胞衍生的基本上纯的同源人角质形成细胞群和任选的药学可接受的载体或赋形剂的药物组合物。

本发明也涉及制备人皮肤替代品的方法，所述方法包括以下步骤：提供本发明的由人多能干细胞衍生的基本上纯的同源人角质形成细胞群的器官型培养。

本发明还涉及可由上述方法获得的人皮肤替代品。

本发明还涉及用上述人皮肤替代品移植动物的方法。

本发明还涉及可由上述方法获得的人皮肤的动物模型。

最后，本发明涉及用于治疗与皮肤损伤有关的病症的上述人皮肤替代品。

本发明的详细说明

定义：

如本文所使用的，术语“标志物”指的是在细胞表面或细胞内表达的蛋白质、糖蛋白或其他分子，且其可用于帮助识别细胞。标志物一般可由常规方法检测。可用于检测细胞表面标志物的方法的特定的非限制性例子是免疫组织化学、荧光激活的细胞分选(FACS)和酶学分析。

术语“人角质形成细胞群”指的是能够重建人表皮以及其特征在于能在将分化为角质层的死的和完全角质化细胞的过程中产生角蛋白的细胞群。基底角质形成细胞的标志物包括具有角蛋白5、14(K5/K14)和转录因子p63的基底层的标志物、具有角蛋白1和角蛋白10(K1/K10)的上基底层的标志物、外皮蛋白(involucrin)、抗角蛋白微丝聚集蛋白(filaggrin)和具有整联蛋白α6和β4、层粘连蛋白-5和胶原质VII的真皮-表皮联结的特异性标志物。

如本文所使用的，术语“人多能干细胞”指的是具有形成任何成体细胞的能力的任何人前体细胞。