[发明专利]用于有机酸生产的改良的酵母菌株

说明书

本发明涉及用酵母生产有机酸。更具体地，本发明涉及生产有机酸的酵母并涉及通过过量表达一种或多种己糖转运蛋白的酵母生产有机酸的方法。

发明背景

在食品和药学工业中广泛使用多种有机酸，并且有机酸作为化学工业的新结构单元材料引起越来越多的关注(Werpy，T.和G.Petersen，Top Value Added Chemicals From Biomass.2004，US Department of Energy：Oak Ridge TN)。特别地，如果它们通过环境友好的发酵策略产生的话，则它们提供了对石油衍生的并因此是有限的结构单元材料的合理的备选。此类有机酸的例子包括乳酸、柠檬酸、衣康酸和琥珀酸。

用于此类方法的微生物包括细菌、丝状真菌和酵母。但是，此类方法具有许多不利之处，特别地导致所需的长发酵期间和由于与高浓度杂质混合的低产物浓度而致的高的酸纯化成本。

成本是决定此种方法是否能真正用于结构单元生产的备选的至关重要的因素。因此，人们寻找用微生物提高有机酸生产的生产性(productivity)的方法。增加生产性的一个领域是增强生产菌株的强壮性。

例如，具有低pH的培养基对于有机酸的生产是有利的，因为由此产生游离酸而非阴离子形式，这通常降低纯化成本。但是，此种生产环境对微生物产生了高的应激：培养基是酸化的，从而细胞不得不积极地抵销跨质膜的增加的pH梯度。在低的外部pH时，有机酸对细胞产生额外的应激，因为它们通过质膜扩散并酸化胞质。假定有这种应激，通过使用本领域现有技术的话存在生产性的限制，因为微生物细胞最终将丧失生存力和代谢活性。

抵销这种效应的一个可能性是分离更强壮的微生物菌株，即，在低pH能够改善生存力和代谢活性的菌株。已提出了用于此类选择或分选策略的方法，例如US 20050112737和US 20070065899。

事实上，用于增加生产性的许多方法依赖于假定生产环境(如酸应激)限制了生产性，如之前所述。用于菌株改进的另一主要关注涉及产物形成率本身，这是从参与产物形成的酶活性被增强的意义上来说的。

通常增强的酶活性的例子包括重要的代谢途径如糖酵解，其通常提供用于生产有机酸所需的中间体。

但是，即使已知在酵母如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中，糖酵解流调节的一个决定步骤是糖摄取，也就是将糖跨细胞膜转运，从未考虑将该事实用来在微生物中提高有机酸生产的生产性。

本发明涉及通过提高己糖摄取来提高微生物的有机酸生产性。

已经显示在酿酒酵母(S.cerevisiae)中通过过量表达己糖转运蛋白能够改善CO₂和乙醇生产(EP0785275，US6159725，Perez等人，2005，Guillaume等人，2007，和Gutiérrez-Lomelí等人，2008)。

但是，从未描述过己糖摄取对用微生物进行有机酸生产的影响。

糖摄取可以是微生物生产有机酸、特别是在低pH生产有机酸的限制因子似乎是难以相信的，但是令人吃惊的是，在酵母菌株中过量表达己糖转运蛋白可以如下所述改进其有机酸生产性。

在面包酵母中，至今已知20种基因编码类似于葡萄糖(己糖)转运蛋白或与己糖摄取相关的蛋白质(HXT1至HXT17、GAL2、SNF3和RGT2)。已进行了许多不同的研究来确定这些转运蛋白各自的特征(亲和性和能力(capacity))、以及构建缺失了一种或多种HXT基因和不同组合的菌株、和最终构建组合了不同转运蛋白的亲和性和能力的嵌合蛋白。

发明概述

本发明的一个目的是提供用过量表达至少一种己糖转运蛋白的酵母生产有机酸的方法。

相对于不过量表达己糖转运蛋白的酵母菌株，至少一种己糖转运蛋白的过量表达提高了有机酸的生产性。

酵母菌株可能表达涉及目的有机酸生产的进一步的基因。在充分的培养基中通过培养过量表达己糖转运蛋白的酵母生产有机酸，从而在培养基中积聚目的有机酸并随后通过本领域已知的技术纯化至所需的程度。

此外，我们显示通过己糖转运蛋白过量表达决定的糖酵解流的增加不仅对微生物生产性而且对生物质累积可以具有积极的作用。相比背景酵母，所述现象可以是或多或少明显的。

附图简述：

图1：在酿酒酵母GRF18U菌株中(过量)表达HXT1或HXT7基因。