[发明专利]用于控制致病体的核酸序列和氨基酸序列

说明书

发明领域

本发明涉及农牧业生物技术领域，特别是涉及抗病原体性蛋白质(anti-pathogenic protein)在控制致病体(pathogenic agent)中的用途。当应用该抗病原体性蛋白质(要么通过其在经遗传修饰的植物中的表达，要么通过生物制品)时，获得高水平的对于由植物的致病体所产生的疾病的控制。

现有技术

已经从作物例如萝卜、洋葱、苜蓿、辣椒、马铃薯和大豆的叶、叶鞘、根、块茎、茎、果实和花中分离出了植物抗病原体性蛋白质。已经在生物化学以及结构水平上研究了这些抗病原体性蛋白质，因此知晓，它们是大约5KDa、由45至54个氨基酸组成、富含半胱氨酸、高度碱性的小肽，并且它们带正电荷。植物抗病原体性蛋白质的家族在氨基酸组成方面是不同的，因为只有稳定结构的八个半胱氨酸看起来是保守的。该特征反映了由不同的植物抗病原体性蛋白质所展示出的多种多样的生物学活性(Broekaert等人，(1995)Plant Physiol.108：1353-8)。

根据前体蛋白质的结构，可以将植物抗病原体性蛋白质分为两组；在第一组中，前体蛋白质由来自内质网的信号肽和成熟蛋白质结构域组成。该蛋白质进入分泌途径并且不具有关于转录后加工的明显信号。在第二组中，抗病原体性蛋白质由长的前体形成，其除了包含信号肽和成熟结构域以外，还包含大约33个氨基酸的C-末端前结构域。迄今为止，仅在茄科物种中发现了此类抗病原体性蛋白质(Lay和Anderson(2005)Curr Protein Pept Sci.6：85-101)。不是所有的植物抗病原体性蛋白质都具有相同的作用模式，有些展示出有效的针对广泛多样的丝状真菌的体外活性，即使以μM的浓度；其他则不抑制真菌生长，但却抑制α-淀粉酶和合成过程的蛋白质的活性(Colilla等人，(1990)FEBS Lett.270：191-194)。

解释了大多数抗病原体性蛋白质的活性的模型为Shai-Matsuzaki-Huang模型，其解释了肽与质膜相互作用，随后为由于该带正电荷的蛋白质在其与靶细胞表面的带负电荷的磷脂发生相互作用后插入到细胞膜中而引起的脂质移位，这造成在质膜内形成多聚体孔，这些多聚体孔构成电压依赖性离子渗透通道(Thomma等人.(2002)Planta 216：193-202)。

另一个模型基于这样的理论：许多抗病原体性蛋白质不仅通过细胞质膜的渗透化而且还通过细胞质靶标来发挥其作用，这些蛋白质一旦在靶细胞内就会影响脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)和蛋白质的合成。这暗示，这些阳离子蛋白质引起细胞质膜渗透化的能力可能并不是作用模式的主要原因，而只是寻找细胞内靶标的途径(Thomma等人，(2003)Curr Drug Targets Infect Disord.3：1-8)。

迄今为止，已鉴定和表征了许多类型的抗微生物蛋白质，它们的可能的应用是多种多样的，因为遗传工程通过细胞和分子工具而提供了针对植物中的疾病的抵抗策略(Thomma等人，(2003)Curr Drug Targets Infect Disord.3：1-8)。已显示，萝卜的抗病原体性蛋白质的组成型表达增加了烟草植物对于叶的病原真菌长柄链格孢(Alternaria longipes)的抗性(Terra等人，(1995)Plant Cell 7：573-588)，这与在具有马铃薯早疫病链格孢(Alternaria solani)的番茄中所出现的相同。此外，苜蓿的抗病原体性蛋白质的组成型表达还在马铃薯的栽培中提供了高的对于在农艺学上具有重大重要性的真菌大丽花轮枝孢(Verticillium dahliae)的抗性，即使在田间条件下(Gao等人，(2000)Nat.Biotechnol.18：1307-1310)。

此外，对组成性地表达甘蓝(Brassica oleracea)和芸苔油菜(B.campestris)这些物种的抗病原体性蛋白质基因的水稻植物进行修饰以置换不同位置处的氨基酸，并且独个地引入到水稻植物中以寻找对于真菌灰色大角间座壳(Magnapothe grisea)和细菌水稻黄单胞菌(Xanthomonas oryza e)(在亚热带和热带国家中具有重大重要性的疾病)的抗性。这些抗病原体性蛋白质在这两种疾病中都赋予了有效的抗性，并且这些抗病原体性蛋白质的基因的修饰导致转基因水稻中广谱抗性的增加(Kawata等人，(2003)JARQ 37：71-76)。