[发明专利]样品中感兴趣结构的高空间分辨率成像

说明书

技术领域

本发明涉及用于样品中感兴趣结构的高空间分辨率成像的方法，所述方法包括权利要求1的前序部分的特征。

背景技术

WO 2006/127692 A2公开一种用于样品中感兴趣结构的高空间分辨率成像的方法，其中使用以所谓的可光学变换(phototransformable)的光学标记为形式的可切换荧光染料对感兴趣结构进行标记。将标记的子组(subgroup)分别激活为该标记的子组能够被激发以发射荧光的状态。各自的子组包括如此少的标记以使得这些标记位于到彼此的距离大于用于将样品成像到传感器阵列上的空间分辨率极限的位置。这使得在将子组的标记激发为发荧光之后，能够以比应用于将样品成像到传感器阵列上的空间分辨率的衍射极限更好的分辨率定位(localize)荧光的初始位置，从而也以该提高的分辨率分别记录被标记的感兴趣结构的点。在WO 2006/127692中限定了可光学变换的光学标记，其中这些光学标记能够由激活信号开启到这些光学标记可以被激发以发射荧光的状态。该激活信号可以与随后将标记激发为荧光的激发光相同。在WO 2006/127692中公开的可光学转换的光学标记的更加具体的实施例仅仅包括可光学激活的荧光蛋白质，即只有在已经吸收了至少一个光量子之后才变为荧光团的分子，或者换句话说，这些分子在成为荧光之前需要被初始开启。激活或者切换过程需要改变分子的分子结构(原子团的重新定位或者甚至键的断开或者形成键合)。WO 2006/127692公开的方法也被称为PALM(光学激活的定位显微术)。

被称为STORM(随机光学重构显微术)并且由Rust等人在Nature Methods，3，793-796(2006)中描述的类似方法同样使用可切换为荧光状态的分子，即可切换的荧光染料，尽管这些不是蛋白质而是可光学切换的有机荧光团，尤其是荧光染料Cy3和Cy5。已知这些青色素(cyanine)染料能够在不同的构象(conformational)状态，特别是同质异构状态，之间切换。

PALM和Storm方法的缺陷在于，不能够预测样品中感兴趣结构将何时被记录到这样完全的程度而使得确定进一步分子的位置将不会提供任何附加的有用信息并且因此终止了该方法。

在C.Geisler，A.C.von Middendorff，H.Bock，C.Eggeling，A.Enger和S.W.Hell在Appl.Phys.A 88，223-226(2007)中发表的标题为“Resolution ofλ/10in fluorescence microscopy using fast single molecule photo-switching”的文章中描述了一种用于样品中感兴趣结构的高空间分辨率成像的方法，该方法包括权利要求1的前序部分的特征，并且被称为PALMIRA(具有独立运行的采集的PALM)。这里，使用可切换的荧光蛋白质标记样品中感兴趣结构。具体地说，是名称为rsFastLime的蛋白质，通过波长为488nm的光，不仅在其初始状态下被激发为发荧光而且还被部分地关闭为非荧光状态并且自此再次被局部切换回到其荧光状态。内在机制是荧光团的构象改变。利用仅具有单一波长的光，可切换的荧光蛋白质的这些特性使得能够交替地建立蛋白质的可发荧光的分子的子组，在该子组中，可发荧光的分子位于比衍射极限大的共同间隔处，并且将可发荧光的分子激发为发荧光。从而能够连续，即以高频率，记录图像，该图像注册(register)荧光分子的交替子组，并且能够以超出衍射极限的精度确定图像中各自注册的分子的位置。利用图像的求和，以比衍射极限精细的空间分辨率记录样品中的结构。

由上面解释的方法使用的可切换荧光蛋白质已经在US 2004/0212799A1和US 2006/0038993 A1中描述的用于样品中感兴趣结构的高空间分辨率成像的方法(被称为RESOLFT(可逆可饱和的光学荧光转换))中首次使用。