[发明专利]植物降解材料的合成和应用

说明书

背景技术

用于合成纤维素乙醇的生物质，其组成和多样性取决于高浓度下多酶体系所释放出的用于制备纤维素乙醇的糖。目前所有用于合成纤维素乙醇的酶均通过价格昂贵的发酵系统制得，并采用与胰岛素等生物制药类似的工艺进行纯化。因此，用于生产乙醇的试剂级酶价格极其昂贵。如目前Sigma产品目录上Novozyme公司销售的β-葡萄糖苷酶、果胶酶和纤维素酶，其价格分别为12.4万美元/kg、41.2万美元/kg和4.049万美元/kg。在未标注酶成分的情况下，上述酶被添加到生物炼厂的配方中。因此，大批量销售的酶的真实价格难以估算。酶生产纤维素乙醇的成本预计为2～3美元/加仑，这导致大规模应用的成本显著提高。除此之外，目前发酵系统的产能仍较为有限。随着对酶需求量的不断增加及有限产能之间的矛盾日益突出，酶的价格有望进一步提高。

制约生物质转化为乙醇发展的主要原因在于生产成本过高，而水解过程又需大量酶的参与。目前Sigma目录上Novozyme公司销售的或其他公司生产的β-葡萄糖苷酶、果胶酶和纤维素酶，其价格分别为12.4万美元/kg、41.2万美元/kg和4.049万美元/kg。因此，美国能源部早就指出酶的价格及相对于绝大多数木质纤维素原料而言较高的负荷水平是纤维素乙醇生产的主要障碍。目前，所有市售酶均采用发酵工艺制备，但发酵工艺的装置建造和维护费用高昂，通常需5～9亿美元的预投资。而取代生产成本高昂的发酵工艺的批量生产工艺尚未出现。本发明即阐述了这一领域的市场空白。

附图说明

图1(a)为叶绿体16S trnI/trnA片段图示。转基因被植入烟叶叶绿体基因组的trnI/trnA间区。(b)叶绿体转化载体图示。感兴趣的基因(GOI)为celD、celO、pelA、pelB、pelD、角质酶、lipY、egl1、egI、swo1、xyn2、axe1或bgl1。Prrn、rRNA启动子促进剂；aadA、氨基糖苷-3’-腺苷酰(基)转移酶基因抵抗奇霉素；5′UTR、促进剂和psbA基因的5′未翻译区；3′UTR、psbA基因的3′未翻译区。(c)经由pelB印迹法所进行的转基因整合和同型异源性评估。(d)pelD和(e)celD叶绿体转基因线与侧序列探针杂交(1未转化；2～4叶绿体转基因线)。(f)未转化的显型(UT)和在温室生长的叶绿体转基因线均显示正常生长。

图2蛋白质印迹分析和叶绿体转基因线定量分析。叶绿体转基因线的蛋白质印迹表达为(a)PelB或(b)PelD。UT：未转化成熟叶片在10AM，2PM，6PM和10PM进行采摘；5ng、10ng和25ng：PelA纯化的蛋白质，未成熟、成熟和旧叶片。(c)PelB和PelD(c)或CelD的酶单元(d)不同年份或采摘时间下的叶片，其质量为1g或100mg。

图3基材、pH、温度和辅因子对cpPelB、rPelB、cpPelD、rPelD、rCelD和cpCelD酶活性的影响。(a)PGA浓度增长对果胶酸裂解酶活性的影响。(b)无CaCl₂存在下，pH对果胶酸裂解酶活性的影响以及(c)CaCl₂存在下，pH对果胶酸裂解酶活性的影响。所用缓冲溶液如下：50mM磷酸盐缓冲溶液(pH 6-7)，Tris缓冲液(pH 8)，甘氨酸/NaOH缓冲溶液(pH 9)以及CAPS缓冲溶液(pH 10.0)，含有从植物和肠埃希氏菌所获得的含有4μg TSP的PelB和PelD。以2.5mg/ml PGA为基材，在40℃下对最佳pH进行测定。(d)无CaCl₂存在下，pH＝8.0时温度(30-70℃)对酶活性的影响和(e)CaCl₂存在下，pH＝8.0时温度(30-70℃)对酶活性的影响。(f)为cpCelD和rCelD活性在60℃ CMC(2％)情况下进行30分钟的pH值最优化。依据最大活性，cpCelD和rCelD的相对活性(％)分别为25μg/ml和10μg/m。(g)在pH＝6.0，CMC(2％)下进行30min研究温度升高对cpCelD和rCelD相对活性的影响。依据最大活性，cpCelD和rCelD的相对活性(％)分别为25μg/ml和10μg/m。(h)长期酶水解中通过，分别采用10mM CaCl₂和20μg/ml BSA或上述两种溶液或50mM醋酸钠的混合溶液对cpCelD(25μg TSP/ml反应)活性提高进行研究。上述水解在CMC(2％)存在下于60℃，pH＝6.0的条件下反应36小时。