[发明专利]含有细胞因子诱导杀伤细胞的细胞群的制造方法

说明书

技术领域

本发明涉及过继免疫疗法中高效的含有细胞因子诱导杀伤(CIK)细胞的细胞群以及该细胞群的制造方法等。本发明涉及的含有CIK细胞的细胞群中调节性T细胞(regulatory T cells；Treg细胞)的增殖被抑制，可用于早期和晚期癌症以及包括造血细胞和实体瘤在内的各种细胞增殖性疾病的治疗。

背景技术

近年来，人们重新审视药物疗法和放射疗法之类的给患者带来严重肉体痛苦的治疗方法，开始越来越关注痛苦小的免疫疗法。该疗法包括例如过继免疫疗法，其对取出至体外的免疫相关细胞进行培养使其细胞数目增加，和/或增强与治疗效果相关的活性后，再移植给患者。

过继免疫疗法中作为效应细胞而利用的细胞，已知有淋巴因子激活的杀伤(lymphokine activated killer；LAK)细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(tumour infiltrating lymphocyte；TIL)以及细胞因子诱导杀伤(cytokine-induced killer；CIK)细胞。

LAK细胞是通过在白细胞介素(IL)-2存在下使淋巴细胞增殖而得到的细胞群，具有能溶解肿瘤细胞但不溶解正常细胞的性质。关于LAK细胞的制备，已开发出在培养时使抗CD3抗体与IL-2共存的方法。

TIL是浸润到了肿瘤组织的T细胞，与LAK细胞相比，具有更显著的肿瘤抗原特异性。该细胞也可以在体外增殖并用于治疗。但是，TIL必须摘取患者的肿瘤组织才能获得，因此采集操作繁杂，得到的细胞数也很少。

CIK细胞可由末梢血单核细胞(PBMC)在干扰素(IFN)-γ、抗CD3抗体以及IL-2的存在下进行培养来制备。CIK细胞是作为含有CD3阳性、CD56阳性细胞的细胞群而具有特征的PBMC中稀有细胞群，但在没有靶细胞的存在下可以使该细胞群优先增殖。CIK细胞在体内发挥比LAK细胞更胜一筹的针对肿瘤细胞的细胞杀伤活性(例如非专利文献1)。

纤维连接蛋白是存在于动物血液、培养细胞表面、组织的细胞外基质中的分子量25万的巨大糖蛋白，已知具有多种功能。其结构域有7个(参照图1)。而且，其氨基酸序列中含有3种类似的序列，由上述各序列的重复构成整体。3种类似的序列分别被称为I型、II型、III型。其中，III型由71～96个氨基酸残基构成，这些氨基酸残基的一致率为17～40％。

利用DNA重组技术，制得多种纤维连接蛋白的片段，可期待其中有些具有抑制癌转移的作用(非专利文献2)。此外，还报道具有肝素结合域的纤维连接蛋白片段具有促进逆转录病毒感染细胞的功能(非专利文献3)。

针对移入由体外诱导的细胞毒T细胞(cytotoxic T cell；CTL)或末梢血淋巴细胞等在IL-2和抗CD3抗体的作用下经放大培养得到的淋巴因子激活的细胞的免疫疗法中，如何在将体外诱导的抗原特异性CTL放大培养时维持细胞毒活性、如何能在体外高效地放大培养淋巴细胞等问题，探讨了使用纤维连接蛋白或其片段所产生的效果(例如专利文献1～3)。

以往技术文献

专利文献

专利文献1    国际公开第03/016511号小册子

专利文献2    国际公开第03/080817号小册子

专利文献3    国际公开第2005/019450号小册子

非专利文献

非专利文献1  J.Immunol.，1994年，Vol.153，p1687-1696

非专利文献2  J.Biochem.，1991年，Vol.110，No.2，p284-291

非专利文献3  Nature Medicine，1996年，Vol.2，No.8，p876-882

发明内容

在CIK细胞的放大培养过程中，PBMC分化为多个性质不同的细胞群，因此放大后的细胞群中的CIK细胞比例必定不高。另一方面，在分化得到的细胞群中还含有具有控制或抑制免疫的功能的细胞群。本发明的目的在于提供用于制造被称为过继免疫疗法的优选细胞群的CIK细胞的、不必要的细胞群含量少的癌治疗用细胞群的放大培养方法。

下面，对本发明进行概述。本发明的第1发明涉及含有CIK细胞的细胞群的制造方法，其特征在于，包含如下工序，即在纤维连接蛋白片段的存在下，培养含有能分化成细胞因子诱导杀伤细胞的细胞的细胞群。第1发明的方式可提供在含有选自VLA-4结合域、VLA-5结合域以及肝素结合域中的区域的纤维连接蛋白片段的存在下，实施培养的含有CIK细胞的细胞群的制造方法。