[发明专利]包含检测细胞角蛋白7的mRNA用引物的试剂

说明书

技术领域：

本发明涉及用于检测试样中细胞角蛋白7(以下称作“CK7”)mRNA的引物及引物组、以及含有这些引物及引物组的试剂。

背景技术：

CK7是可见于上皮细胞的中间纤维结构蛋白质——细胞角蛋白的一种，最近有报告称其可作为检查肺癌、食道癌等淋巴结转移的分子标记使用。例如，非专利文献1表明：将从生物体上采集的淋巴结调制成测定试样，用核酸扩增(RT-PCR)法检测该测定试样中的CK7mRNA，可以以较高的特异性来判断非小细胞性肺癌的淋巴结转移情况。

非专利文件1：Pulte等，癌症，2005，104卷，N0.7，1453-61.(CANCER2005，vol.104，NO.7，1453-61.)

发明内容：

发明想要解决的问题：

如上所述，CK7的mRNA可作为检测癌症的分子标记使用。以往的技术是用RT-PCR法来检测CK7的mRNA。该RT-PCR法是核酸扩增法，具有高敏感度，即使是癌细胞向淋巴结的微转移也可检测出来，但是，这种检测非常花时间(通常需2-4小时左右)。

因此，本发明的目的是提供与以往的技术相比能够在短时间内检测出CK7的mRNA的引物以及引物组。

解决该课题的方法：

本发明提供可检测CK7的mRNA的引物。该引物在其5′端有第一序列，在3′端有第二序列。其第一序列长为10～30个核苷酸，可与序列号1的序列中所含区域——第一区域相对的互补链杂交，其第二序列长为10～30个核苷酸，在序列号1的序列中，可与比上述第一区域更靠近3′端的第二区域杂交。

发明效果：

本发明可以提供与以往的技术相比能够在短时间内检测出CK7的mRNA的引物以及引物组。

附图说明：

图1为检测CK7的mRNA用的引物以及引物组杂交的核酸区域的示意图。

具体实施方式：

本说明书中，所说的“检测”不仅是要判断试样中是否存在本发明的靶物质CK7的mRNA，还包括给试样中的CK7的mRNA定量。

“引物”是指，在LAMP(环介导等温扩增反应，loop-medicatedIsothermal Amplification)法(参照美国专利第6410278号公报以及美国专利第6974670号公报)等核酸扩增技术中，与扩增对象的核酸的特定区域进行杂交的多核苷酸，该多核苷酸具有能成为由聚合酶引起的扩增反应起点的功能(以下，称为“引物功能”)。因为检测对象的核酸是CK7的mRNA，所以，可以通过包含逆转录反应的核酸扩增反应(例如：RT-LAMP法等等)将其检测出。

“杂交”是指在严格(stringent)条件下，基于多核苷酸碱基的互补性，某多核苷酸的部分或全部序列与其它多核苷酸的部分或全部序列，通过氢键结合。

“严格条件”是指进行多核苷酸杂交时，该行业者普遍使用的条件，本实施方式的引物只要满足能与CK7mRNA或其cDNA进行杂交这一条件，则无特殊限制。大家了解的杂交时的严格条件是指温度、盐浓度、引物长度、引物中GC含量以及杂交缓冲液中的离液剂浓度函数。例如严格条件，可以使用Sambrook，J.等，1998，分子克隆：实验手册(第2版)，冷泉港实验室，纽约(Molecular Cloning：A Laboratory Manual(第2编)，Cold SpringHarb or Laboratory Press，New York)所记载的条件等。更具体一些可以是：“在含有50％甲酰胺、5×SSC(150mM NaCl，15mM柠檬酸钠)、50mM磷酸钠、pH7.6、5×丹哈特溶液(Denhardt’s溶液)、10％硫酸葡聚糖以及20μg/ml核酸的溶液中进行，杂交温度为42℃”，但并不限于此。

本实施方式的引物，对于使用RT-LAMP法来进行的CK7的mRNA的检测特别适用。CK7的mRNA的核苷酸序列见序列号1。虽然mRNA中含有的是尿嘧啶而不是胸腺嘧啶，在序列号1上为易于标注，将尿嘧啶表示为胸腺嘧啶(t)。这个序列，在GenBank数据库中登记为序号NM_005556。

RT-LAMP法首先是通过逆转录反应(RT反应)由mRNA合成cDNA，合成的cDNA通过LAMP反应得到扩增。使用RT-LAMP法检测CK7的mRNA时，可以将多核苷酸作引物使用，该多核苷酸在5′末端侧有可与CK7的mRNA序列所包含的R1c区域的互补区域R1区杂交的第一序列，在3′末端侧有第二序列可与CK7的mRNA序列中位于R1c区域下游(3′端)的R2c区域杂交。