[发明专利]质粒载体

说明书

技术领域

本发明涉及一种质粒载体，所述质粒载体包含编码复制蛋白的基因，对于制造外源蛋白有用。

背景技术

近年来，积极开展了基因工程研究，报道了很多使用重组微生物大规模生产有用蛋白质的技术。作为一个大量生产蛋白质的例子，可以提及具有高生产率的质粒载体的发展。例如，一种包括涉及胞外酶生成例如淀粉酶、蛋白酶或果聚糖蔗糖酶的各种基因启动子区，以及包括编码涉及这些蛋白质胞外分泌的信号肽区的表达和分泌载体(专利文献1和2)；一种复制区被改动以增加其拷贝数的载体(专利文献3和4)等。

然而，按照通常使用的、基于宿主载体系统制造蛋白质的方法，蛋白质的产量仍不足。另外，也限制了可以大量生产的蛋白质的种类。

专利文献1：JP-A-01-273591

专利文献2：JP-A-2000-287687

专利文献3：JP-A-06-327480

专利文献4：JP-A-2003-9863

发明内容

本发明针对下列1)～11)。

1)一种质粒载体，含有编码质粒复制蛋白的DNA，其中，

所述复制蛋白包括选自用序列识别号2表示的氨基酸序列中的(a)位置48、(b)位置262、(c)位置149和(d)位置198的一个或多个氨基酸残基被下列氨基酸残基取代而成的物质，

(a)位置：丙氨酸、甘氨酸、苏氨酸、精氨酸、谷氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺，

(b)位置：甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸或缬氨酸，

(c)位置：天冬酰胺，

(d)位置：谷氨酸。

2)一种质粒载体，含有编码质粒复制蛋白的DNA，其中，

所述复制蛋白包括与用序列识别号2表示的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列中的选自分别与序列识别号2中的(a)位置48、(b)位置262、(c)位置149和(d)位置198相对应的位置处的氨基酸残基中的一个或多个氨基酸残基被下列氨基酸残基取代而成的物质，

(a)位置：丙氨酸、甘氨酸、苏氨酸、精氨酸、谷氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺，

(b)位置：甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸或缬氨酸，

(c)位置：天冬酰胺，

(d)位置：谷氨酸。

3)上述1)或2)的质粒载体进一步包含基因的启动子区和分泌信号区的核苷酸序列，其中，所述基因编码源于芽孢杆菌属微生物的碱性纤维素酶。

4)上述3)的质粒载体，其中，编码源于芽孢杆菌属微生物的碱性纤维素酶的基因的启动子区和分泌信号区的核苷酸序列是：

具有由用序列识别号13表示的核苷酸序列组成的纤维素酶基因的1～659号碱基的核苷酸序列；具有由用序列识别号14表示的核苷酸序列组成的纤维素酶基因的1～696号碱基的核苷酸序列；与前述任意一个核苷酸序列具有至少70％同一性的核苷酸序列；或前述核苷酸序列中部分被删除的核苷酸序列。

5)一种转化体，其含有上述4)的质粒载体。

6)上述5)的转化体，其中，载体的宿主是微生物。

7)一种制备多肽的方法，其包括如下步骤：

构建质粒载体，所述质粒载体包含编码目标多肽的DNA和编码质粒复制蛋白的DNA，

所述复制蛋白包括选自用序列识别号2表示的氨基酸序列中的(a)位置48、(b)位置262、(c)位置149和(d)位置198的一个或多个氨基酸残基被下列氨基酸残基取代而成的物质，

(a)位置：丙氨酸、甘氨酸、苏氨酸、精氨酸、谷氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺，

(b)位置：甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸或缬氨酸，

(c)位置：天冬酰胺，

(d)位置：谷氨酸；

用质粒载体转化宿主微生物；以及

培养宿主微生物，并收集由此生成的目标多肽。

8)一种制备多肽的方法，其包括如下步骤：

构建质粒载体，所述质粒载体包含编码目标多肽的DNA和编码质粒复制蛋白的DNA，

其中，所述复制蛋白包括与用序列识别号2表示的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列中的选自分别与序列识别号2中的(a)位置48、(b)位置262、(c)位置149和(d)位置198相对应的位置处的氨基酸残基中的一个或多个氨基酸残基被下列氨基酸残基取代而成的物质，

(a)位置：丙氨酸、甘氨酸、苏氨酸、精氨酸、谷氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺，

(b)位置：甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸或缬氨酸，

(c)位置：天冬酰胺，

(d)位置：谷氨酸；