[发明专利]GRG31和GRG36 EPSP合酶的定向进化

说明书

发明领域

本发明涉及植物分子生物学，特别是赋予提高的除草剂草甘膦抗性或耐受性的新EPSP合酶多肽。

发明背景

N-膦酰基甲基甘氨酸通常称为草甘膦，是一种重要的农事化学品。草甘膦抑制将磷酸烯醇丙酮酸(PEP)和3-磷酸莽草酸(S3P)转化成5-烯醇丙酮酰-3-磷酸莽草酸的酶。对该酶(5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶；本文称为“EPSP合酶”或“EPSPS”)的抑制通过关闭莽草酸路径、由此抑制芳族氨基酸生物合成而杀死植物细胞。

由于草甘膦类除草剂抑制芳族氨基酸生物合成，故它们不仅杀死植物细胞，而且还对细菌细胞有毒。草甘膦抑制许多细菌EPSP合酶，因而对这些细菌有毒。不过，某些细菌EPSP合酶对草甘膦具有高耐受性。

植物细胞对草甘膦毒性的抗性可以通过转化植物细胞使之表达抗草甘膦的细菌EPSP合酶而产生。特别地，来自根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)CP4株的该细菌基因已经用来继在植物中表达后赋予植物细胞除草剂抗性。来自鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)CT7株的突变EPSP合酶赋予细菌细胞草甘膦抗性，并赋予植物细胞草甘膦抗性(美国专利No.4,535,060；4,769,061；和5,094,945)。

美国专利6,040,497报道了突变玉米EPSP合酶，具有102位苏氨酸至异亮氨酸取代、以及106位脯氨酸至丝氨酸取代(“TIPS”突变)。这些改变赋予所述玉米酶草甘膦抗性。来自鼠伤寒沙门氏菌CT7株的突变EPSP合酶赋予细菌细胞草甘膦抗性，而且据报道赋予植物细胞草甘膦抗性(美国专利No.4,535,060；4,769,061；和5,094,945)。He等人((2001)Biochim etBiophysica Acta 1568：1-6)通过诱变以及重组大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌EPSP合酶基因，开发了草甘膦耐受性增加的EPSP合酶，并提出42位(T42M)和230位(Q230K)的突变很可能是造成所观察到的抗性的原因。随后的工作(He等人(2003)Biosci.Biotech.Biochem.67：1405-1409)表明，T42M突变(苏氨酸突变为甲硫氨酸)足以提高大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌酶的耐受性。由于除草剂抗性植物提供许多优势，期望除草剂抗性基因提高的草甘膦抗性活性。

其他的诱变方法描述在2006年6月13日递交的、发明名称为“全排列诱变”的美国专利No.60/813,095中。

发明概述

本文提供了赋予抗性或耐受性的组合物和方法。组合物包括抗草甘膦除草剂的EPSP合酶，编码此类酶的核酸分子，含有那些核酸分子的载体，以及含有载体的宿主细胞。组合物包括编码除草剂抗性多肽的核酸分子，包括编码SEQ ID NO：2和4的多肽变体的那些核酸分子。在多个实施方案中，多肽变体如SEQ ID NO：7-28所示。这些编码序列可用在DNA构建体或表达盒中，用于转化生物体，包括微生物和植物，及在其中表达。组合物还包括通过将本发明组合物引入生物体基因组中而呈草甘膦抗性的转化细菌、植物、植物细胞、组织和种子。在生物体是植物的情况下，引入所述序列允许对所述植物施加含草甘膦的除草剂，以选择性地杀死草甘膦敏感性杂草或其他未转化的植物，而非转化的生物体。这些序列还可以用作为标记，以选择在草甘膦条件下生长的植物细胞。

另外还提供了鉴定具有草甘膦抗性活性的EPSP合酶的方法。所述方法包括基于本发明结构域的存在来鉴定具有草甘膦抗性的其他EPSP合酶序列。

发明详述

现在将于下文参照附图更充分地描述本发明，附图中显示了一些但非所有的本发明的实施方案。事实上，本发明可以有多种不同形式的实施方案，故而不应阐释为局限于本文所阐释的实施方案；相反，这些实施方案是为了使发明公开满足适用的法律要求而提供的。通篇相似的数值适用于相似的要素。

在得益于前述说明以及所附附图中所给出的教导的情况下，本发明所属领域的技术人员自然会想到本文所阐释的本发明的许多变动和其他实施方案。所以，应当理解本发明不局限于所公开的具体实施方案，且变动和其他实施方案旨在落入所附权利要求书的范围之内。虽然本文采用了具体术语，但其仅仅是在一般性和描述性意义上使用的，而不是为了构成限制。