[发明专利]亚硫酸氢化核酸的扩增

权利要求书

1.用于核酸扩增的反应混合物，所述反应混合物包含dATP、dTTP、dCTP和dGTP，以及包含尿嘧啶的核酸，其特征在于dATP和dTTP的起始浓度高于dCTP和dGTP的起始浓度。

2.权利要求1的反应混合物，其中dATP和dTTP的起始浓度为dCTP和dGTP起始浓度的200％到600％，优选为dCTP和dGTP起始浓度的300％到500％。

3.前述权利要求任一项的反应混合物，还包含至少一组引物。

4.权利要求3的反应混合物，其中至少一组引物对所有情况下的未亚硫酸氢化的变体特异和/或对核酸的至少一个亚硫酸氢化的变体特异。

5.权利要求3或4的反应混合物，其中至少一组引物对至少一个CpG岛核酸序列特异，该CpG岛核酸序列的甲基化状态与表型或疾病相关。

6.前述权利要求任一项的反应混合物，其中dCTP和dGTP的起始浓度是20-3000μM、50-2000μM或100-1000μM。

7.前述权利要求任一项的反应混合物，还包含至少一种聚合酶。

8.权利要求7的反应混合物，其中聚合酶是链置换聚合酶。

9.权利要求7的反应混合物，其中聚合酶是热稳定聚合酶。

10.权利要求7-9任一项的反应混合物，其中聚合酶选自Phi29-DNA聚合酶，Vent DNA聚合酶、Deep Vent DNA聚合酶、BstDNA聚合酶、9oNm DNA聚合酶、Bca DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶、Tth DNA聚合酶和/或Klenow exo minus DNA聚合酶，以及上面提到的聚合酶的修饰形式，包括“热启动聚合酶”。

11.权利要求7-10任一项的反应混合物，其还包含连接酶。

12.用于扩增通过亚硫酸氢化反应转变的核酸的方法，所述方法包括下列步骤：

a.将亚硫酸氢化的核酸与至少一组引物、至少一种聚合酶以及dATP、dTTP、dCTP和dGTP接触；和

b.利用所述至少一种聚合酶扩增所述核酸，

其特征在于dATP和dTTP的起始浓度高于dCTP和dGTP的起始浓度。

13.权利要求12的方法，其中dATP和dTTP的起始浓度为dCTP和dGTP起始浓度的200％到600％，优选为dCTP和dGTP起始浓度的300％到500％。

14.权利要求12或13的方法，其中核酸与至少两个相应引物组接触，所述引物组对所有情况下的未亚硫酸氢化的变体特异和/或对核酸的至少一个亚硫酸氢化的变体特异。

15.权利要求12-14任一项的方法，其中引物组对至少一个CpG岛核酸序列特异，该CpG岛核酸序列的甲基化状态与表型或疾病相关。

16.权利要求12-15任一项的方法，其中核酸与5到10、10到20、20到50、50到100、100到250或250个以上的这种引物组接触。

17.权利要求12-16任一项的方法，其特征在于核酸在连接酶存在下进行扩增。

18.权利要求12-17任一项的方法，其中扩增在等温下或利用温度循环来进行。

19.权利要求18的方法，其中扩增是RCA、MDA、SDA或PCR。

20.用于分析核酸的甲基化状态的方法，所述方法包括下列步骤：

a.对核酸进行亚硫酸氢化；

b.按照权利要求12-19任一项，对来自步骤a的亚硫酸氢化的核酸进行扩增；以及

c.检测由于所述亚硫酸氢化从胞嘧啶转变成尿嘧啶的核酸碱基，

其中每个检测到的尿嘧啶对应于原始核酸中存在的未甲基化的胞嘧啶。

21.权利要求1-11任一项的反应混合物或权利要求12-20任一项的方法，其中核酸是DNA。

22.权利要求21的反应混合物或方法，其中DNA是基因组DNA或线粒体DNA。

23.试剂盒，具有权利要求1-11和/或21-22任一项的反应混合物。