[发明专利]一步法病原体核酸荧光定量PCR检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种核酸荧光定量PCR检测方法，尤其是涉及一种一步法病原体核酸荧光定量PCR检测方法。

背景技术

血清中病毒核酸的提取，目前主要有四种方法：(1)直接煮沸法：向血清中加入核酸裂解液，直接煮沸，高速离心，上清即为模板；其优点是易于操作；缺点是不能有效去除血清中抑制PCR的因素，弱阳性经常无扩增；(2)煮沸法：先将血清浓缩，再加裂解液，煮沸，高速离心，上清为模板，是目前国内临床通用的方法；这种方法能部分去除撝苯又蠓蟹″中无法去除的抑制性因素，缺点在于浓缩这一步，不同厂家的浓缩效果不一样，有的可以看到沉淀，有的无法看到，看得到沉淀的是因为将病毒与蛋白都浓缩了，这样，导致后面加入裂解液时很难充分混匀；无法看到沉淀，使操作者无法确定吸弃上清时会不会吹打到病毒核酸；(3)柱提取法：血清通过裂解，过柱后核酸吸附到膜上，通过两次洗涤，最后洗脱下来的为模板；这种方法相对前两种提取方法而言，提取的核酸纯度大大提高，不但可用于下游PCR实验，还可用来做其他分子生物学实验，缺点是手工操作过多，效率低，且无法自动化；(4)磁分离方法：磁分离是利用功能化磁性纳米颗粒的表面配体(或受体)与受体(或配体)之间特异性相互作用来实现对靶向生物目标的快速分离；目前，磁分离方法已广泛应用于核酸(DNA和RNA)、蛋白质、酶、细胞等多种生物物质的分离与纯化；磁分离方法提取核酸可称得上是提取核酸的终极方法，因为此方法具备上述所有方法的优点，并且能轻而易举实现自动化。不过，所用试剂基本上为国外所垄断，价格非常昂贵，从而限制了其在我国的广泛应用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种操作简单快速，抗污染，干扰能力强，提取的核酸无损失，快速准确，所用试剂制造成本低的一步法病原体核酸荧光定量PCR检测方法。

本发明的技术方案是：针对待测病原体核酸选取保守基因序列，设计特异性引物探针，采用一种核酸快速释放试剂提取病原体核酸，直接加入相应的PCR反应液，实现PCR荧光定量检测。

所述核酸快速释放试剂由0.01～0.5mM/L(与KCl水溶液的质量体积比)的表面活性肽溶解于50～200mM/L的KCl水溶液，0.01％～2％(与无菌水的质量体积比)的SDS(十二烷基磺酸钠)、LLS(Lithium lauryl sulfate，十二烷基硫酸锂)或Chelex-100(Chelex树脂)，以及0.05％～1％(体积)的乙醇组成。

所述核酸快速释放试剂配制方法：以无菌水、KCl配制50～200mM/L的KCl溶液，加入表面活性肽，使表面活性肽浓度达到0.01～0.5mM/L，加入0.01％～2％(与无菌水的质量体积比))的SDS、LLS或Chelex-100，加入0.05％～1％(体积)的乙醇，即配成本发明之核酸释放试剂。

所述百分比以无菌水体积为计算基准(下同)。

本发明结果判断：理想的标准品扩增曲线：基线平整，NTC无模板，不产生引物二聚体，一直是水平线；指数区较明显，斜率大且固定；平台区汇于一起，线性范围广。理想的标准曲线：斜率接近于-3.322，一致性系数接近1.000，理想的重复性，同一样本CT值变异系数＜10％，浓度变异系数＜50％。

本发明优点：整个样本处理和检验过程在一个PCR反应管中即可完成，无需离心、振荡、更换离心管等一系列繁琐操作，不但简化了操作步骤，节省了耗材成本，而且无需加热，开/关管盖，移液等可能导致核酸丢失与污染的操作，抗污染能力强，实验结果的重复性大大提高，对操作人员的技术要求较低；还节省了时间成本，可以让临床医生及患者及早得到诊断结果，避免等待试验结果的焦虑。

总之，本发明一步法实现PCR荧光定量检测，操作简单快速，抗污染抗干扰能力强，提取的核酸无损失，所用试剂制造成本低。

附图说明

图1(a)为本发明方法检测HBV DNA标准品的荧光定量PCR扩增曲线；

图1(b)为本发明方法检测HBV DNA标准品所作标准曲线；

图2(a)为对照方法(离心柱法)提取HCV RNA并进行荧光定量PCR检测扩增曲线；

图2(b)为本发明方法重复性检测HCV RNA阳性样本的荧光定量PCR扩增曲线；

图3为本发明方法检测沙眼衣原体(CT)阳性样本的荧光定量PCR扩增曲线。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步说明。

实施例1用于HBV DNA的荧光定量PCR检测