[发明专利]一种西兰花体细胞胚诱导植株再生的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种体细胞胚诱导植株再生的方法。

背景技术

西兰花(Brassica oleracea L.var.italica Planch)又名青花菜、绿菜花、茎椰菜、 木立花椰菜、意大利芥蓝等，是一、二年生草本植物，营养价值较高，含有丰富的维生素A 和维生素C，以及含量可观的维生素B1、B2、B5、钙和铁等物质，并含抗癌物质，受到消费 者的青睐。青花菜栽培历史较短，但发展很快，在我国已成为一些地区出口创汇的重要优质 蔬菜种类之一。同时，美国、日本等国家育成的杂种一代品种在国内外市场上畅销，我国也 育出一批品种。

西兰花的组织培养自20世纪70年代以来相继有所报道，研究的最初目的是实现离体快繁 ，借以扩大稀缺种质资源的数量，满足育种和生产上的需要。随着青花菜育种工作的深入， 品种虽然增多，但是限于优良基因资源的缺乏，在抗虫、延熟保鲜、抗某些病害等特性品种 的选育上，常规育种较难开展。基因工程的发展为转入外源有益基因以创新种质提供了捷径 ，西兰花的遗传转经研究已有一些报道，但转化率普遍较低。建立植物成熟高效的再生体系 是遗传转化中重要的1个环节，一方面有利于转化细胞的分化再生；另一方面可以保障获得 尽可能多的可供筛选的再生植株，从中得到外源基因表达正常的转基因植株。

体胚发生途径和器官发生途径是进行无性繁殖的很重要的途径，同时也是进行转基因研 究的前提。目前，已经利用西兰花的各种外植体通过器官发生途径进行了体外的增殖，但目 前西兰花通过器官发生的离体再生方式普遍存在诱导分化时间长、繁殖率低和不同品种间分 化率差异大的问题，如Qin Ying等的研究表明，外植体培养4～5周以后才开始形成不定芽， 每个外植体产生的不定芽数仅能达到1.6～4.1，研究的4种西兰花基因型的体细胞胚诱导率 差异大，最低为74.4％，最高为92.5％。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有西兰花通过器官发生进行离体再生方法存在的诱导分化时 间长、繁殖率低以及不同品种间分化率差异大的问题，而提供了一种西兰花体细胞胚诱导植 株再生的方法。

本发明西兰花体细胞胚诱导植株再生的方法通过以下步骤进行的：一、先用质量浓度为 65％～75％的酒精对西兰花种子消毒50～70s，再用质量浓度为0.8％～1.2％的次氯酸溶液消毒 10～16min，然后用无菌水冲洗3～5次；二、将消毒后的西兰花种子接种于萌发培养基中培 养6～8天，培养温度为20～25℃，即得到西兰花幼苗；三、用刀将西兰花幼苗中的子叶、下 胚轴或根切成0.5～10mm的小段后接种到固体诱导培养基或液体诱导培养基中培养，培养温 度为20～25℃，在无光照条件下培养7～10天得到球形胚，然后将球形胚从母体上分离出来 再接种到液体诱导培养基中，在温度为20～25℃的条件下培养14～20天得到成熟体细胞胚； 四、将成熟体细胞胚接种到1/2MS固体培养基或者再生培养基中培养，培养温度为20～25℃ ，培养时间为28～30天，即完成了西兰花体细胞胚诱导植株再生；其中，步骤二中的萌发培 养基是以MS培养基为基本培养基，且每1L的萌发培养基中还包含18～22g的蔗糖和7～9g的琼 脂，pH值为5.6～6.0；步骤三中的固体诱导培养基是MS培养基为基本培养基，且每1L的诱导 培养基还包含0.2～1.2mg的2，4-二氯苯氧乙酸、18～22mg的蔗糖和7～9g的琼脂，pH值为 5.6～6.0；步骤三中的液体诱导培养基均是以MS培养基为基本培养基，且每1L的诱导培养基 还包含0.2～1.2mg的2，4-二氯苯氧乙酸和18～22mg的蔗糖，pH值为5.6～6.0；步骤四中的 再生培养基是以1/2MS固体培养基为基本培养基的改良培养基，且每1L的改良培养基中还包 含0.8～1.2mg的苄基氨基嘌呤或0.8～1.2mg的赤霉素，pH值为5.6～6.0。