[发明专利]一种寡糖分子疫苗的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种细菌性抗原的制备方法，具体涉及一种从细菌细胞壁多糖中提取具有免疫原性寡糖的方法。

背景技术

早在20多年前，世界上著名的鱼病预防专家埃利斯(Fllis，1998)在他所书写的《鱼类疫苗》一书中郑重指出：“由一种称为革兰氏阴性，无动力的细菌——产气单胞菌(Aeromonas)所致的疥疮病(Furunculosis)是沙门鱼最严重的疾病之一，在所公开发表的某些疫苗的效应方面，尤其是那些灭活的全细胞或细胞外产物疫苗越来越引起人们的关注，但未必令人兴奋。”原因是自1942年自鱼类疫苗祖先Duff开创疫苗以来，人们曾经历过组织悬浆疫苗，灭活疫苗，减毒活菌苗，细菌表面结构蛋白质疫苗与脂多糖疫苗等不同阶段的探索与尝试，其中大部分则处于模式形式而停留在实验室研究阶段。尽管在历史上传统疫苗曾起到一定的作用，但总体来说，均存在着保护率低，具有毒性或异体反应性，在多数情况下，只对某一特定的血清型细菌起反应，而且疫苗用量大，往往需要二次免疫，同时，由于这些疫苗多为蛋白质，蛋白衍生物或糖蛋白，包括重组疫苗在内，均需要在低温条件下保存，极易受各种理化因素的影响而减效或失效，因此，在使用、运输、保存上带来许多不便。如果为减毒活菌苗，还存在着复毒的危险。即从实际意义来说，在我国除草鱼出血病毒疫苗(它是通过将病、死的鱼研碎，取之悬浆加热或福尔马林处理而成的灭活疫苗)外，尚未有一种有效的水产动物细菌疫苗在生产中应用。包括常见的，严重危害淡水养殖中的产气单胞菌，以及海水鱼类病害的罪魁祸首——弧菌属(Vibrio)病原菌。显然。传统上所用的一些产气单胞菌疫苗，在种间存在着表面抗原的差异，针对某一种菌的免疫力并非对另一种菌感染有预防作用，因此，较为理想的疫苗应是在同属不同种间，不同的血清型间具有共同的抗原性，起到属内交叉保护作用——广谱疫苗。

发明内容

本发明的目的是提供一种寡糖分子疫苗的制备方法，该疫苗可预防多种同类属细菌引起的疫病。

本发明的目的通过以下技术方案实现；

(1)大规模细菌培养

将单一个纯的菌落自固体培养基上转种于适当量的液体培养基中，再将其逐级转种至各种大体积的液体培养基中，在适当的温度与时间进行培养；

(2)收集细菌细胞

用低温高速离心将细菌从悬液中沉淀下来；

(3)破裂细菌细胞

将细菌沉淀物，用EDTA将细胞破解，使胞浆内容物与胞壁分离；

(4)提取细菌细胞壁脂多糖

首先用热水将苯酚结晶配成一定浓度，并将胞壁溶液稀释，与等量苯酚溶液

混合；隔水加热，间隔旋转震荡；然后置于冷环境中两小时，使水相与酚相分离，分别收集水相与酚相脂多糖粗制品；

(5)回收菌细胞壁脂多糖

两相脂多糖粗制品分别装在分子量2000道尔顿的透析袋内，先经流动自来水透析，然后，再将之置于蒸馏水透析，其间不断更换蒸馏水，透析后的脂多糖粗制品浓缩回收；

(6)去蛋白与核酸

剩余的少量蛋白质、核酸、脱氧核糖核酸，经蛋白酶、核酸酶、脱氧核糖核酸酶将之消化；经反复低温超速离心，可使脂多糖的蛋白与核酸含减少至最低程度；

(7)去除类脂A

用强酸、强碱溶液交替加热处理以及使用电化学方法使类脂A分子去除；

(8)提取具有免疫原的寡糖分子

用现代分子生物学和免疫化学的方法，从多糖中分离出具有特异性高、抗原性强的寡糖分子，再将其回收、浓缩、真空冷冻干燥。

寡糖分子疫苗的研制是基于革兰氏阴性细菌细胞壁核心多糖的寡糖部分，在同一属菌的不同种中具有共同抗原成分，它既有种的特异性又有属的特异性的原理，这一点在以该寡糖分子作为免疫原制备的单克隆抗体与分子生物学的免疫转印技术加以证实。本技术发明涉及到几乎所有的致病性革兰氏阴性细菌，包括弧菌(Vibrio)、气单胞菌(Aeromonas)、沙门氏菌(Salmonella)、埃希氏菌(Ecsherichia)、志贺氏杆菌(Shigella)、假气单胞菌(Pseudomonas)、爱德华氏菌(Edwarseilla)、耶尔森氏菌(Yersinia)、空肠弯曲菌(Campylobacter)、屈挠杆菌(Flexibacter)、军团菌(Legionella)、奈瑟氏球菌(Neisseria)、巴斯德氏菌(Pastuerella)、博代氏杆菌(Bordetella)、变形杆菌(Prodeus)等。