[发明专利]检测乙肝感染相关基因STR位点的方法、试剂盒及应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测与乙肝病毒感染相关的IL-10基因两个STR位点的基因型的方法、所用的试剂盒以及在乙肝病毒感染的人群预防和控制、遗传咨询中的应用，属于乙肝病毒易感性的遗传学检测技术领域。

背景技术

根据乙肝病毒(HBV)感染和发病特点的研究，乙型肝炎的发生、发展过程与宿主遗传因素相关，并且对乙肝防治的疗效和预后具有一定的影响作用，宿主对HBV感染的遗传易感性在HBV感染发病和疾病进展方面都发挥着重要作用。研究乙型肝炎的宿主遗传易感性具有十分重要的意义，不但能够为我们理解HBV感染种族性差异提供关键线索，也能够为我们以后的抗病毒治疗和疾病的预防提供新的思路。近年来在乙型肝炎的宿主遗传易感性方面的研究中主要关注于一些细胞因子的基因多态性与HBV感染的关系，其中一个重要的细胞因子即是IL-10。

人类IL-10基因定位于1号染色体，其基因组包括5个外显子和4个内含子。IL-10整个基因均含有大量的SNP位点，其中以启动子区最多。IL-10基因的启动子区具有高度多态性，含多个单核苷酸多态性位点以及2个微卫星重复序列IL-10.G和IL-10.R，分别是位于-1193～-1151位点的IL-10G微卫星体(含有16个等位基因)和位于-4004～-3987位点的IL-10R微卫星体(含有5个等位基因)。IL-10基因2个微卫星重复序列IL-10.G和IL-10.R有研究报道与肾移植排斥反应和系统性红斑狼疮相关，但尚无与HBV感染相关的研究报道。

在人类基因组中，STRs是高度多态性标记的丰富来源，可采用PCR反应检测。STRs-PCR(短串联重复序列或微卫星DNA聚合酶链式反应)方法的基本原理是，针对待检测的微卫星(STR)多态性位点设计引物进行PCR扩增，由于扩增的重复序列重复次数存在差异，使得扩增产物片段大小不同，STR基因座的等位基因分型也不同，在电泳分离后，荧光检测可区别不同的基因型。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种检测与乙肝病毒感染相关的IL-10基因两个STR位点的基因型的方法、所用的试剂盒以及在乙肝病毒感染的人群预防和控制、遗传咨询中的应用。

本发明人首次将IL-10.G和IL-10.R位点多态性与HBV感染联系起来探讨其相关性，首次在贵州少数民族中进行了IL-10基因IL-10.G和IL-10.R位点多态性与乙肝病毒感染相关的大规模、高通量研究，并且结果显示IL-10.G与HBV感染存在相关性。经过一系列探讨研究之后，本发明采用STRs-PCR方法，通过对IL-10启动子区IL-10.G和IL-10.R两个STR位点的基因型进行检测，从而可判断个体对乙肝病毒的易感性，确定了IL-10.G、IL-10.R是乙肝病毒感染的新型相关基因，为乙肝病毒感染的人群预防和控制提供了新的遗传咨询内容。

本发明的技术方案：一种检测与乙肝病毒感染相关的IL-10基因两个STR位点的基因型的方法，所述方法为STRs-PCR，即短串联重复序列或微卫星DNA聚合酶链式反应，具体包括以下步骤：

(1)采取血样，红细胞悬液经过酚氯仿抽提基因组DNA后，用TE缓冲液溶解制备模板DNA；

(2)IL-10.G与IL-10.R两个STR位点的引物设计：IL-10.R微卫星PCR扩增的引物序列为：5′-CCCTCCAAAATCTATTTGCATAAG-3′、5′-CTCCGCCCAGTAAGTTTCATCAC-3′；IL-10.G微卫星PCR扩增的引物序列为：5′-TTCCTCCCAGTTACAGTCT-3′、5′-CACCATCTCCAGCACATA-3′；

(3)PCR扩增体系的组配：10×PCR缓冲液、MgCl₂、dNTPs、上游引物G/R、下游引物G/R、Taq DNA聚合酶、模板DNA和去离子水；

(4)混匀反应体系，瞬时离心后上机，进行PCR循环反应；

(5)ABI310测序仪自动荧光检测并分析PCR产物：向PCR产物中加入去离子甲酰胺进行变性，然后置于ABI 310测序仪中进行毛细管电泳及荧光检测，再用GeneScan软件对产物片段进行准确测定，后利用产物片段大小的数值进行基因分型。

前述步骤(3)中的PCR扩增试剂为10×PCR缓冲液、25mmol/L的MgCl₂、2.5mol/L的dNTPs和5U/μl的Taq DNA聚合酶。