[发明专利]一种用于核酸扩增的环形引物及其应用

权利要求书

1.一种用于核酸扩增的环形引物，该引物为一条寡核苷酸，其特征在于：该寡核苷酸的3’端为与靶序列互补的靶序列识别区，5’端为与靶序列识别区互补的3-20个碱基，在合适条件下，5’端和3’端可以相互结合为双链，使引物形成一个环状结构；当引物与靶序列识别并杂交时，双链结构被打开，环形结构消失，引物从自身双链变为与靶序列结合的双链而获得DNA延伸能力。

2、如权利要求1所述的一种用于核酸扩增的环形引物，其特征在于：所述的环形引物进一步包括一个突变识别区。

3、如权利要求2所述的一种用于核酸扩增的环形引物，其特征在于：所述的突变识别区位于靶序列识别区的3’末端或靶序列识别区内部。

4、一种扩增核酸的方法，采用上游引物F及下游引物R，其特征在于：其中至少有一条引物为环形引物，该环形引物的3’端为与靶序列互补的靶序列识别区，5’端为与靶序列识别区互补的3-20个碱基，在合适条件下，5’端和3’端可以相互结合为双链，使引物形成一个环状结构；当环形引物与靶序列识别并杂交时，双链结构被打开，环形结构消失，引物从自身双链变为与靶序列结合的双链而获得DNA延伸能力。

5、如权利要求4所述的一种扩增核酸的方法，其特征在于：所述的环形引物进一步含有一个突变识别区。

6、如权利要求5所述的一种扩增核酸的方法，其特征在于：所述的突变识别区位于靶序列识别区的3’末端或靶序列识别区内部。

7、一种用于核酸扩增的环形引物，该引物为一条寡核苷酸，其特征在于：该寡核苷酸的3’端为与靶序列互补的靶序列识别区，5’端为与靶序列识别区互补的3-20个碱基，在合适条件下，5’端和3’端可以相互结合为双链，使引物形成一个环状结构；

引物内部带有一个通用标签序列，在合适条件下，引物的3’端形成双链，引物内部形成一个环形结构，当引物与靶序列识别并杂交时，双链结构被打开，环形结构消失，引物从自身双链变为与靶序列结合的双链而获得DNA延伸能力。

8、如权利要求7所述的一种用于核酸扩增的环形引物，其特征在于：所述的环形引物的进一步包括一个突变识别区。

9、如权利要求8所述的一种用于核酸扩增的环形引物，其特征在于：所述的突变识别区位于靶序列识别区的3’末端或靶序列识别区内部。

10、如权利要求7所述的一种用于核酸扩增的环形引物，其特征在于：引物总长度为35-80bp，靶序列结合区16-40bp，通用标签序列16-30bp。

11、一种采用环形引物扩增的方法，其特征在于：体系中含有三条引物，分别为上游引物F、下游引物R、通用引物T，其中：

上游引物F和下游引物R中至少有一条为环形引物，该环形引物的3’端为与靶序列互补的靶序列识别区，5’端为与靶序列识别区互补的3-20个碱基，在合适条件下，5’端和3’端可以相互结合为双链，使引物形成一个环状结构；

上游引物F和下游引物R内部各带有一个相同的通用标签序列；

在合适条件下，环形引物的3’端与自身的互补序列形成双链，引物内部形成一个环形结构，当引物与靶序列识别并杂交时，双链结构被打开，环形结构消失，引物从自身双链变为与靶序列结合的双链而获得DNA延伸能力；

通用引物T的序列与上下游引物F、R中的标签序列完全相同。

12、如权利要求11所述的一种采用环形引物扩增的方法，其特征在于：所述的环形引物中进一步包括一个突变识别区。

13、如权利要求12所述的一种采用环形引物扩增的方法，其特征在于：所述的突变识别区位于靶序列识别区的3’末端或靶序列识别区内部。

14、如权利要求11所述的一种采用环形引物扩增的方法，其特征在于：环形引物总长度为35-80bp，靶序列结合区16-40bp，通用标签序列16-30bp。

15、如权利要求11所述的一种采用环形引物扩增的方法，其特征在于：标签序列T的添加量为引物F及R总添加量的10倍以上。

16、如权利要求11所述的一种采用环形引物扩增的方法，其特征在于：扩增包含以下几个部分：1）预变性；2）包括变性、引物退火和引物延伸循环的第一部分PCR扩增；3）包括变性、引物退火和引物延伸循环的第二部分PCR扩增，其中：

步骤2）扩增的退火温度为60～66℃；

步骤3）扩增的退火温度为54～58℃。