[发明专利]一种融合蛋白免疫抑制剂及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术和医学领域，具体涉及融合蛋白技术及其在医学中的应用，具体涉及融合蛋白HLA-G/IgG作为安全、高效的免疫抑制剂用于治疗与防治移植排斥反应、自身免疫性疾病及炎症性疾病。

背景技术

免疫抑制剂广泛用于抗移植排斥反应、自身免疫性疾病及炎症性疾病的治疗。常用的有环孢素A、FK506、抗人CD3单抗等，其通存的副作用是继发感染、诱发肿瘤和药物毒性作用等。

HLA-G属非经典HLA-I类分子，生理状态下，仅表达于母胎界面和某些免疫豁免组织细胞表面，提示它是一类诱导免疫耐受的分子以及在同种移植中的潜在应用(1)。体外研究资料显示HLA-G可1)抑制NK细胞和CD8+T细胞的杀伤活性(2，3)；2)抑制CD4+T细胞的增殖(4，5)；3)阻碍同种反应性T细胞的细胞周期进展(6)；4)抑制抗原递呈细胞(APC)的成熟(7)；5)诱导活化的CD8+T细胞的凋亡(8，9)；6)诱导调节性T细胞(Tr)的产生(10，11)。HLA-G是通过与抑制性受体结合后传递抑制信号发挥作用的(11-13)。这些受体包括表达在T、B、NK、DC细胞表面的ILT2，以及髓细胞表面特有的ILT4(14-19)。ILT2、ILT4均能与CD8竞争性的结合HLA-I类分子，但与HLA-G的亲和力最高(19)。

最近研究资料显示HLA-G发挥生物学功能依赖于两个HLA-G分子通过二硫键联结而成的二聚体。HLA-G可以通过42位(位于α1区)特有(区别于其他HLA-I类分子)的半胱氨酸残基(Cys42)形成的分子间二硫键构成二聚体，并且这种二聚体形式与抑制性受体ILT2的亲和力远远高于单体(20-25)。Gonen-Gross T首先应用定点突变的方法发现ILT2-Fc融合蛋白与HLA-G二聚体的结合力远远强于单体(22)，这为Shiroishi M KK应用表面等离子共振(SPR)所证实(25)，更为直接的体内证据是Apps R GL应用免疫共沉淀的方法发现ILT2主要结合正常胎盘来源的HLA-G二聚体(20)。与受体间亲和力的增强必将导致HLA-G二聚体在信号传导、生物学功能发挥方面比单体更优越(22，25)。虽然HLA-G二聚体形式占到膜型HLA-G总量的高达40％，但对细胞自然产生的可溶性HLA-G来说，二聚体形式仅占很少的一部分(＜5％)(20)，这对于可溶性HLA-G的后续研究以及生物学应用是很不利的。

与常用的免疫抑制剂比较，HLA-G具有如下优点：1)安全性好：HLA-G是多态性极少的人体自身成分，且在母婴时期曾大量接触过，不会产生过敏反应和肝肾毒性作用。HLA-G一旦从环境中撤离，有如婴儿娩出，机体免疫功能会很快恢复至常态。2)特异性强：HLA-G是通过与抑制性受体结合后传递抑制信号发挥作用的，只针对活化后具有其受体的细胞，如T、B、NK、DC细胞等。对未活化的免疫细胞与其它组织细胞产生不发挥作用，可避免免疫细胞耗竭或大量减少，防止继发感染和诱发肿瘤。因此，HLA-G有望成为一种理想的免疫抑制剂，有广泛的应用前景。

开发HLA-G作为免疫抑制剂难点在于难以在体外获得大量具有功能的HLA-G。其主要原因如下：1)虽可通过原核表达系统获得足量的HLA-G，但其在较高的浓度下(10μM)不能发挥免疫抑制效应；真核表达系统的产物虽能发挥免疫抑制功能，但产量低。2)HLA-G发挥生物学功能依赖于两个HLA-G分子通过二硫键形成的二聚体。细胞自然产生的可溶性HLA-G主要以单体形式存在，二聚体形式仅占5％，其免疫抑制作用效率较低。

本发明将编码HLA-G的α1-α3区与人IgG的CH1-CH3区的基因重组、表达，获得较高浓度融合蛋白(每ml培养上清含2μg)，即融合蛋白sHLA-G/IgG。经非还原型SDS-PAGE发现该融合蛋白主要是以二聚体形式存在，另有少部分通过Cys42-Cys42形成更高分子量多聚体。增殖抑制实验表明重组融合蛋白sHLA-G/IgG可在1纳摩尔水平显著抑制同种反应性T细胞CD8+T、CD4+T细胞的增殖，抑制同种反应性特异性CTL的产生，并且上调同种反应性CD8+T细胞表面ILT2的表达，而ILT2的上调又可进一步促进HLA-G二聚体的抑制作用。且比天然状态HLA-G单体更有效，其抑制效率是HLA-G单体的近十倍。本发明提供的这种融合蛋白可以作为免疫抑制剂，用于制备免疫抑制剂类药物，用于抑制移植排斥反应(包括器官移植、骨髓移植以及干细胞移植)，治疗自身免疫性疾病和炎症性疾病。

发明内容