[发明专利]一种荧光蛋白突变体BeRFP

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域。

背景技术

目前决大多数荧光蛋白或荧光分子的Stocks位移(激发峰与发射峰之 间的距离)在20-60nm以内。大Stocks位移荧光分子成像时可有效地减少 不同荧光分子之间的光谱串扰。

发明内容

本发明的目的是解决上述问题而提供一种荧光蛋白突变体BeRFP，该荧 光蛋白突变体的Stocks位移很大，同时能用作细胞的标记与成像。

本发明所采用的技术方案是：

一种荧光蛋白突变体，该荧光蛋白突变体是在红色荧光蛋白Kate基础 上对V93S,S158D,D159Y,L174A,Y210S进行突变，其蛋白质序列为: MVSKGEELIKENMHMKLYMEGTVNNHHFKCTSEGEGKPYEGTQTMRIKVVEGGPLPFAFDILAT SFMYGSKTFINHTQGIPDFFKQSFPEGFTWERSTTYEDGGVLTATQDTSLQDGCLIYNVKIRGV NFPSNGPVMQKKTLGWEASTEMLYPADGGLEGRDYMALKLVGGGHLICNAKTTYRSKKPAKNLK MPGVYYVDRRLERIKEADKETSVEQHEVAVARYCDLPSKLGHKLN。

本发明具有以下优点：

本发明的荧光蛋白突变体BeRFP具有很大的Stocks位移，其荧光蛋白 光谱特性发生了极大的改变,主激发峰与发射峰分别在450nm与616nm。与 类似光谱特性的荧光蛋白分子mKeima相比,本发明的亮度大约提高了大约 一倍。同时该荧光蛋白突变体可以用于细胞的标记与成像。

附图说明

图1为荧光蛋白突变体BeRFP的激发峰与发射峰；

图2为荧光蛋白突变体BeRFP与mKeima在E.coli BL21(DE3)细菌中表 达的荧光亮度比较；

图3为荧光蛋白突变体BeRFP HeLa中细胞定位到内质粒上荧光图。

具体实施方式

本发明是来自物种Entacmaea quadricolor海葵的红色荧光蛋白Kate， 分别在Kate上对V93S,S158D,D159Y,L174A,Y210S位进行突变。由于这个 蛋白是在蓝色波段处激发，在红色波段发射，所以命名为BeRFP(Blue  light-excitted Red Fluoresent Protein)。该荧光蛋白突变体的具体构 建方法为：

1)利用大引物方法,对Kate进行以下定点基因突变:V93S,S158D,D159Y, L174A,Y210S。其具体方安案请与生物学实验手册上的步骤相同:

Kate-V93S-R

5-CGCCCCCGTCTTCGTATGTGGTGGATCTCTCCCATGTGAAGCCCTCAGG-3’

Kate-V97S-F

5-CCTGAGGGCTTCACATGGGAGAGATCCACCACATACGAAGACGGGGGCG-3’

对Kate突变，产生大的Stocks位移引物：对158或159位点进行单位点突变 （S158D，D159Y）

5’-GCTGACGGCGGCCTGGAAGGCAGAGACTACATGGCCCTGAAGCTCGTGG-3’

93号位点V变成S

Kate-V97S

5’CCTGAGGGCTTCACATGGGAGAGAGTCACCACATACGAAGACGGGGGCG3

Kate-Y210S

5CAAGGAGGCCGACAAAGAGACCTACGTCGAGCAGCACGAGGTGGCTGTG3

Kate-L174X-F

5-GGGGGCCACCTGATCTGCAACXXXAAGACCACATACAGATCCAAGAAACCCG-3

Kate-L174X-R

5-CGGGTTTCTTGGATCTGTATGTGGTCTTXXXGTTGCAGATCAGGTGGCCCCC-3。

2)将突变产物克隆到pRSET载体

1.2μg pRSET Vector

12μl PCR回收DNA