[发明专利]中期因子表达量的实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一种检测组织或细胞内中期因子(MK)的两步实时荧光定量RT-PCR试剂盒，属于生物技术领域。该试剂盒可以用于直接检测组织或细胞内的中期因子的mRNA含量，从而对中期因子相关疾病，尤其是癌症的诊断起到指导和参考的作用。

(二)背景技术

中期因子(midkine，MK)是一个新发现的促血管生成因子，它是经过研究所选定的靶向序列。MK蛋是一种具有促细胞转化、促有丝分裂作用、促肿瘤血管生成、抗细胞凋亡和增强纤维蛋白溶解等肿瘤形成相关活性的碱性肝素结合性蛋白质。MK基因主要在胚胎期表达，随着发育的进展表达组织逐渐局限，成年期仅在小肠黏膜、甲状腺、肺、肾、脾组织中微量表达，而且(增添)表达量逐渐减少(移动)。研究证实，MK能调节细胞生长、存活和分化，在许多不同类型的肿瘤中表达增强，包括食管癌、胃癌、结直肠癌、胰腺癌、胆囊癌、肺癌、甲状腺、乳腺、膀胱、子宫、卵巢、前列腺和肝癌、神经细胞瘤、恶性胶质瘤，阳性表达率介于45％～90％之间。MK在肿瘤早期、潜伏期和癌前病变阶段也呈高水平表达。最新研究也发现肝细胞癌(Hepatocellular Carcinoma，HCC)高表达MK，可能参与肝内侵袭、转移，并与肝癌的发生、浸润转移，血管生成及预后密切相关。

这表明MK在许多类型的肿瘤发生和生物学行为起重要作用。Friedrich等通过实验证实了MK在肿瘤发生中的作用，在体内MK促进肿瘤细胞的生长，这种生长与肿瘤血管密度的增加有关，同时证实MK有促进肿瘤血管生成的作用。Ruan等研究证实人口腔癌中MK的表达与肿瘤血管生成相关。血管生成是肿瘤生长和转移的基础，肿瘤细胞生长超过2～3mm就需要有新生血管的生成。生理情况下，血管的生成是由内皮细胞生长因子和内皮细胞抑制因子共同调节的，而肿瘤血管的生成正是这种平衡被破坏，内皮细胞刺激因子过度表达或内皮细胞抑制因子的低表达都可以引起肿瘤血管的生成。MK在肿瘤组织中的过度表达促进了肿瘤血管的形成，促进了肿瘤的生长和浸润。

多项有关MK功能的研究证实其参与肿瘤的生长、分化及肿瘤血管生成等过程，表明MK在肿瘤演化过程中可能具有直接作用。由于MK特异表达于多种肿瘤组织，因而MK成为肿瘤治疗的新靶点，如利用MK抗体能抑制肿瘤细胞的生长。一些针对MK的基因治疗也有显著的抗肿瘤作用。根据MK与肝癌相关研究，MK可能是抗血管生成治疗肝癌的理想靶位。

本发明采用实时荧光定量PCR检测组织或细胞中的MK mRNA表达情况，与Western blotting等蛋白水平上的检测方法相比，本发明具有灵敏度高和准确性好的优点，是药物研究领域中的一个强有力的检测手段。

(三)发明内容

本发明的目的旨在提供一种简便和灵敏度较高的用于检测组织或细胞内的中期因子表达量的试剂盒。

本发明采用的技术方案如下：

一种中期因子表达量的实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒，主要包括中期因子DNA标准品、特异性引物、PCR缓冲液、脱氧核糖核苷酸混合物(dNTP)、DNA聚合酶和DNA荧光染料，

所述特异性引物序列如下：

上游引物MK up：5’-ctc cgc ggt cgc caa aaa gaa aga-3’；

下游引物MK down：5’-ccc cca tca cac gca ccc cag tt-3’

为达到定量检测的要求，本发明试剂盒中还可包括中期因子DNA标准品，所述中期因子DNA标准品序列如下：

5’- ctccgcggtcgccaaaaagaaagataaggtgaagaagggcggcccggggagcgagtgcgctgagtgggcctgggggccctgcacccccagcagcaaggat tgcggcgtgggtttccgcgagggcacctgcggggcccagacccagcgcatccggtgcagggtgccctgcaactggaagaaggagtttggagccgactgca

所述试剂盒中还可包括内参引物GAPDH作为对照，所述内参基因的引物序列如下：

上游引物GAPDH up：5’-gga gcc aaa agg gtc atc atc t-3’

下游引物GAPDH down：5’-agg ggc cat cca cag tct tct-3’

所述GAPDH基因DNA标准品序列如下：