[发明专利]一种分泌细菌复苏促生长因子的重组卡介苗疫苗及其应用

说明书

技术领域

本发明属于医药生物技术领域，涉及一种重组卡介苗(rBCG)疫苗，特别涉及一种分泌细菌复苏促生长因子的重组卡介苗疫苗及其应用。

背景技术

1、重组BCG是制备TB疫苗的有效途径

卡介苗疫苗(BCG)是一种减毒的活牛型分枝杆菌，是目前预防结核病最有效的疫苗，自1948年以来世界上已有35亿人接种。随着研究的深入，人们发现BCG不仅是一种活疫苗，而且也是外源基因的表达载体，这个发现为BCG的应用开辟了新领域。

rBCG(Recombinate BCG)是将BCG作为工程菌，利用基因工程技术将几种外源基因导入同一BCG中，依靠BCG在宿主细胞内的长期存活而得到表达。通常是将外源目的基因插入卡介苗基因组或其质粒的某些部位使之高效表达，但不影响该疫苗株的生存与繁殖。接种这种重组疫苗以后，除可激发对疫苗同类细菌的保护外，还可获得对所插入外源抗原的免疫，从而建立对相关疾病的保护力。rBCG集佐剂和载体于一身、兼多种外源基因与活疫苗于一体，一次接种，可获得强而持久的多种特异性免疫。更重要的是，rBCG比重组病毒载体更容易开发。

多种病毒、寄生虫和细菌抗原，包括细菌毒素，均可在rBCG中成功表达。在某些rBCG，外源抗原的表达量可占rBCG全部蛋白的15％。对啮齿类动物的实验研究表明，单次接种可诱发强烈的体液免疫，常可持续几个月之久。如果继续接种rBCG可获得高水平的抗体。目前已知，在BCG中表达了多种外源基因，如：HIV-1nef基因、HIV-1gag基因、HIV-1pol基因、HIV-1env基因、HIV-1gp120基因、HIV-1gp41基因、破伤风毒素C片段以及麻风分枝杆菌等基因。然而，值得注意的是有些蛋白则只能分泌于BCG细菌外，方可作为有效的免疫原诱导免疫应答。

目前，rBCG疫苗已广泛用于新型结核病疫苗的研究，MTB的Ag85复合物和ESAT6等保护性抗原来分别或组合构建rBCG，以期诱导机体产生对MTB更强的免疫应答。但也都还存在着一定不足，只有表达分泌蛋白Ag85B的rBCG在豚鼠体内的保护力超过BCG，提示有效的TB疫苗应以rBCG为基础。实验研究表明，现有的TB疫苗尽管可以有效抑制早期MTB的增殖，但对已被巨噬细胞吞噬的MTB则作用甚微，MTB处于潜伏状态，当机体免疫力低下时，处于潜伏状态的MTB又开始进行性生长，导致组织损伤或死亡，人类的TB病例大部分也是这种复发性疾病。因此，理想的TB疫苗诱导的免疫应答应是既能有效抑制早期MTB的增殖，又能有效防止潜伏状态的MTB的激活。

2、Rpf与MTB的相关研究：

细菌复苏促生长因子(Resuscitation-promoting factor，Rpf)最初是在M.luteus(藤黄微球菌)中发现，该因子可以在皮克(10^-12)水平以自分泌和旁分泌形式促进休眠菌的复活和生长，其机制可能是参与了细胞间的信号转导。Rpf除能促使休眠菌复活和生长以外，对正常生长的细菌也有效。由于Rpf的功能类似于真核生物的生长因子，所以被称为细菌的生长因子。

目前已查明了Rpf的氨基酸顺序，并确定了编码这种蛋白的基因。相似的Rpf基因广泛分布在高G+C％含量的革兰氏阳性菌中。研究发现M.Luteus的Rpf蛋白结构域具有与Rpf蛋白一致的生物学功能，代表了Rpf的完整活性。经杂交试验证实在多种分枝杆菌中也存在Rpf基因，在结核分枝杆菌(M.tuberculosis，MTB)H37Rv株和牛分枝杆菌的基因组中Rv0867C(RpfA)、Rv1009(RpfB)、Rv1884C(RpfC)、Rv2389C(RpfD)和Rv2450C(RpfE)基因所编码的蛋白均具有Rpf样作用域，推测这些基因编码的蛋白可能也具有Rpf的促进细菌生长作用。

Rpf蛋白的作用机制尚不清楚，推测可能在细胞外发挥作用，参与了细胞间的信号转导。Rpf蛋白发挥作用在两种情况下是必需的，一种是将低密度细菌接种于培养基时，繁殖生长需要Rpf；Rpf对10²CFU/ml的BCG生长具有明显促进作用，但对10⁵CFU/ml的BCG作用不明显。另外一种情况是休眠菌复苏时需要Rpf，在E.coli中表达的任何一种Rpf样蛋白，在皮克浓度就可以刺激BCG休眠菌的生长。