[发明专利]一种活性炭生物膜DNA提取方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种活性炭生物膜DNA提取方法。

背景技术

活性炭因其易获得、吸附能力强而在污染物处理处置(水处理，废气处理)过程中受到极大重视。活性炭上附着的以微生物及其胞外多聚物为主体的生物膜是一些有害物质生物降解的主体部分。研究活性炭生物膜的微生物群落组成已成为深入了解环境工程中生物处理工艺内在生物学机制的关键。

由于现有技术对绝大多数的环境微生物都无法成功进行室内培养，或者不能反映微生物在工艺过程中的实际功能。因此，分子生物学技术就成为原位研究活性炭生物膜的微生物群落的主要手段。然而，活性炭发达的多孔结构和强吸附能力导致微生物细胞难以从其表面和孔道内洗脱，而且释放出的DNA会被活性炭再次吸附等原因，使得活性炭生物膜的DNA提取困难，产量小，质量低，从而直接抑制下游实验工作如PCR实验，酶切实验，DNA指纹分析(如：DGGE，TGGE和SSCP)等的顺利进行。而且，实际工程中的活性炭颗粒吸附的大量污染物和微生物代谢的有机物，也为DNA的纯化和下游技术造成困难。传统的DNA提取以及目前的市售DNA提取试剂盒产品都不能够理想地解决该问题。因此，如何成功的从活性炭生物膜获得高质量的基因组DNA成为制约深入探讨活性炭工艺中生物学机制的制约因素而亟待解决。

发明内容

本发明的目的是在于解决现有技术的缺陷，提供一种可以成功提取活性炭生物膜DNA的实验方法和试剂配方。以获得纯度和产量均达到适用于下游分子生物学操作的DNA。

本发明提取活性炭生物膜的具体方法如以下步骤：

一、生物膜的解吸附和初步裂解细胞

将活性炭样品盛于无菌离心管中，加入生物膜解吸附溶液。使用超声破碎探头，以200W功率，振荡3秒，停止10秒，进行40个循环。然后放入液氮中冷冻3min，充分冷冻后置于37℃水浴中融解3min。

二、再次裂解细胞

吸取上述粗提液，至新离心管中。加入浓度为20mg/ml的蛋白酶K以及质量浓度为20％的十二烷基磺酸钠，于55℃水浴1h，期间来回颠倒离心管10-20次。

三、DNA纯化

之后向离心管中加入十六烷基三甲基溴化铵盐溶液，以及浓度为5M的NaCl溶液，65℃水浴10min；室温条件下10000rpm离心10min。之后可吸取清液至新的无菌离心管中，使用酚/氯仿/异戊醇方法或硅胶纯化柱等常用方法进行进一步纯化，即可获得高质量的基因组DNA。

本发明活性炭生物膜DNA提取的原理和优点：1.使用碱性的生物膜解吸附溶液配合超声振荡，可以高效的对附着在活性炭上的微生物细胞进行解吸附，其中浓度大于0.1g/ml的脱脂牛奶可以与核酸分子竞争性吸附，可有效防止释放后的DNA分子的重新吸附；2.采用冻融法这一物理裂解配合十二烷基磺酸钠+蛋白酶K法进行快速的细胞裂解和蛋白质杂质去除；3.采用十六烷基三甲基溴化铵盐溶液在高盐浓度环境下去除有机杂质如多糖，腐植酸等；4.综上所述，本发明克服传统DNA提取方法无法成功提取活性炭生物膜DNA模板，克服了碱洗脱生物膜方法对基因组DNA的严重剪切，获得高质量的DNA，不会对下游实验操作造成影响。

附图说明

图1为具体实施例三中5种方法所提取DNA的琼脂糖凝胶电泳图谱，图2为具体实施例四中以6种样品中提取DNA作为模板，进行的16SrDNA的PCR扩增结果琼脂糖凝胶电泳图谱。

具体实施方式

为更好的理解本发明，下面通过具体实施来做进一步说明。

生物膜解吸附溶液的配置：称取蔗糖(分子量342.29)，Tris-Hcl(分子量121.14)，NaCl(分子量58.44)，EDTA(分子量372.24)，无菌脱脂牛奶粉于适量无菌蒸馏水中，使用NaOH调节pH值至≥9.0，121℃湿热灭菌。十六烷基三甲基溴化铵盐溶液的配置：称取NaCl(分子量58.44)溶于适量体积的无菌蒸馏水中，缓慢加入十六烷基三甲基溴化铵(分子量364.10)，加热至50-65℃并搅拌溶解。

实施例一：比较提取附着生物量不同的活性炭样品

样品来源为浙江省平湖市古横桥自来水厂活性炭滤池，滤池活性炭总深度1m，从滤池表层起至底层，共采集6层样品，分别是0cm，-10cm，-20cm，-40cm，-60cm和-80cm，其上所附着生物膜的生物量由上至下逐层递减。比较本发明方法对不同深度活性炭样品的DNA提取效果，具体实施过程如下：