[发明专利]基于雀稗固氮菌的根际促生菌肥及其制备方法

权利要求书

1.雀稗固氮菌，其特征是，通过下述步骤获得：

A.土样采集：样品采自临沂地区小麦根际沉积物，样品采集后装入灭菌的封口聚乙烯袋中，低温保存；

B.培养基：

(1)LB培养基：蛋白胨10g、酵母膏5g、NaCl 10g、Agar 20g，总体积1000ml，pH 7.0-7.5；

(2)NFM培养基：苹果酸5g、K₂PHO₄0.5g、MgSO₄·7H₂O 0.2g、CaCl₂·2H₂O 0.02g、NaCl 0.1g、NaMoO₄·2H₂O 0.002g、KOH 4.5g、Bromothymol Blue 5ml、Biotine 10ug、Agar2％，总体积1000ml，pH7.0-7.5；

(3)CCM培养基：KH₂PO₄0.2g、NaCl 0.1g、K₂HPO₄0.8g、Na2FeEDTA28mg、钼酸钠25mg、酵母浸膏100mg、甘露醇5g、蔗糖5g、乳酸钠0.5ml、蒸馏水900ml；

C.菌株筛选方法：取样品1g，在无菌条件下用0.85％生理盐水配成10^-4、10^-5、10^-6三个稀释度，各稀释度的悬浮液接种于盛有半固体NFM、CCM培养基的血清试管瓶中，28-30℃培养48h后，注入1mlC₂H₂，再置于28-30℃培养24h-48h后，对有C₂H₄产生的样品以平板划线法将其分别再培养于LB、NFM、CCM平板培养基上，置于28-30℃的培养箱中培养24-48h，然后分别挑取不同的典型单个菌落，并接种于新准备的CCM、NFM血清小瓶中，测定其固氮活性，挑选出生长快、圈大的菌落再分离纯化后，转斜面4℃保藏。

2.一种根际促生菌肥，其特征在于：由每500-700g吸附剂中加入130-170ml菌悬液制成，雀稗固氮菌活菌数0.5x10⁸-2x10⁸cfu/g。

3.权利要求2所述的根际促生菌肥，其特征在于：所述的吸附剂为泥炭、活性碳、蛭石或它们的混合物。

4.权利要求3所述的根际促生菌肥，其特征在于：所述的吸附剂为泥炭。

5.一种根际促生菌肥的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

A.菌悬液的制备：

(1)雀稗固氮菌斜面：28-30℃，培养2-3d；

(2)摇瓶种子培养：培养瓶盛培养基300ml，121℃灭菌20-30min，冷却后接入1ml斜面菌株，置于28℃振荡培养，摇床转速125rpm/min，培养时间2-3d；

(3)扩大发酵：300L发酵罐装入培养基150L，121℃灭菌后置于室温下2-3d，经检查无污染后，接入15L种子培养液，置于28℃下的轨道摇床，转速为125rpm/min，培养时间3-4d，所得即为菌悬液；

B.吸附剂的处理：将吸附剂干燥、粉碎，过100目筛，121℃灭菌2-3h，分装500g/袋备用；

C.菌肥接种和培养：用已灭菌的量筒量取150ml菌悬液接种到500g灭菌的吸附剂中，在无菌操作下装入塑料包装袋中立即封口，并将菌悬液与吸附剂混匀，再用灭菌针在塑料袋的四周及中间扎几个孔，置于28-30℃培养6-7d，使雀稗固氮菌进一步繁殖，活菌数均在10⁸个/g，包装后常温下保存，即为根际促生菌肥。

6.权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)的培养基是：蛋白胨10g、酵母膏5g、NaCl 10g、Agar 20g，蒸馏水1000ml，pH 7.0-7.5。

7.权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)和步骤(3)的培养基是：糖浆10g、酵母膏5g、CMC-Na5g、KH₂PO₄0.5g、MgSO₄0.25g、蒸馏水1000ml，pH 7.0-7.5。