[发明专利]一种对金藻的电击转化方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种电击转化方法，具体地说关于一种对金藻(Isochrysissp.CCMM5001)的电击转化方法。

背景技术

金藻是一种分布广泛的海洋浮游单细胞藻类，是水产动物育苗的理想饵料。近来的研究表明，金藻还含有丰富的叶绿素a、叶绿素c、β-胡萝卜素、叶黄素以及不饱和脂肪酸等活性物质，尤其是DHA、EPA含量较高。由于个体小，生长繁殖快，营养丰富，因此金藻是进行基因工程研究的理想材料。

对海洋微藻的电转化研究最早起始于1990年，Matsunaga T利用电转化法将pUSY02质粒转化到了聚球藻(Synechococcus sp)。到现在为止，已进行了基因转化研究的微藻主要有：鱼腥藻(Anabaena)、念珠藻(Nostoc)、双管弗氏藻(Fremyelladiplosiphon)、钝顶螺旋藻(Sirulina platensis)、杜氏盐藻(Dunaliella sallina)、莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)等。采用的转化方法也多种多样，如：基因枪法、玻璃珠法、超声波法、电转化法等。比较这几种转化方法，电转化具有较明显的优势，操作简单，价格低廉，且可以减少操作对结果的影响。

影响藻类电击转化的因素主要有电击电压、质粒浓度、电击缓冲液组成、藻种状态等。Brown的研究结果表明，电击转化后细胞存活率在50％左右时转化率达到最大值。高电容低电压可以降低对藻细胞的伤害，提高细胞存活率，从而提高转化效率。实验过程中发现，传统的电击缓冲液并不适用于金藻，针对金藻的特点，设计了蔗糖-HEPES缓冲液。目前的有关研究表明，对数前期的藻种存活率普遍要高于中期和后期的藻种，但中期的藻种可获得最高的转化率。原因可能是处于对数中期的藻种处于旺盛生长状态，对外界环境比较敏感，对外源基因吸收能力较强。处于对数生长前期的藻种，细胞分裂较少，外源基因不易整合进基因组中。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用电击法将外源基因转化到金藻藻体内的新方法，该方法通过对金藻进行抽滤收集、预处理，采用合适的电压、质粒浓度、电击缓冲液提高了转化效率。

本发明的目的是由以下技术方案实现的：研制了一种对金藻的电击转化方法，该方法通过对金藻进行抽滤收集、预处理、输入电压、质粒浓度、电击缓冲液提高了转化效率，其特征包含如下步骤：

(1)提供金藻藻株Isochrysis sp.CCMM5001、外源性DNA、电转缓冲液；

(2)金藻抽滤收集及电转化前的预处理；

(3)电转化需要的质粒、鲑鱼精DNA的浓度、电击条件设定；

(4)转化后的培养条件；

所述的外源性DNA为pCAMBIA1303质粒。

所述的电转缓冲液蔗糖-HEPES组成为：0.5-1.0mM蔗糖，0.5-1.0mMHEPES，PH6.5-8.0。

所述的抽滤所需要的压力为0.01-0.03Mpa，所用的滤膜为：孔径8μm，规格50mm。

所述的质粒浓度为7-10μg/ml，鲑鱼精DNA的浓度为：4-6μg/ml。

所述的电击条件为1.4-2.5KV，脉冲时间为5-10ms。

所述的转化后细胞暗恢复培养23-25h，加入卡那霉素，光/暗12/12h培养。

本发明的积极效果在于公开一种对金藻的电击转化方法，这是到目前为止首次对金藻进行电击转化的研究，通过采用抽滤收集的方法，减少了对转化藻体的损伤，极大提高了转化效率。

附图说明：

图1为不同脉冲场强对金藻存活率的影响；

图2为不同生长状态对金藻存活率的影响

具体实施方式：

下面结合实例对本发明作进一步的描述：

实施例1

实验采用金藻(Isochrysis sp.CCMM5001)(中科院海洋所海洋微藻藻种库CCMM/KLMEE韩笑天老师提供)，以具有潮霉素(hptII)抗性的质粒pCAMBIA1303(由石河子大学提供)为转化的外源DNA。

所述的电转缓冲液蔗糖-HEPES组成为：0.5mM蔗糖，0.5mMHEPES，PH6.5。

所述的抽滤所需要的压力为0.01Mpa，所用的滤膜为：孔径8μm，规格50mm。

所述的质粒浓度为7μg/ml，鲑鱼精DNA的浓度为：4μg/ml。

所述的电击条件为1.6KV/cm，脉冲时间为5ms。

所述的转化后细胞暗恢复培养23h，加入卡那霉素，光/暗12/12h培养。