[发明专利]应用电旋转技术检测细胞早期凋亡的方法

说明书

技术领域

本发明涉及应用电旋转技术检测细胞发生凋亡过程的生理变化的方法，特别 是检测细胞发生早期凋亡变化的方法。

背景技术

细胞凋亡是指为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序的死亡现象。 它能及时有效地清除体内过量或有潜在危险性的细胞，用于维持体内各种类型细 胞数目的平衡。这种平衡对于促进器官形成以及维持机体内环境的稳定至关重要。 对于凋亡研究的重要意义在于是它开启了我们对于癌症药物研究的一个新的窗 口。但是由于癌细胞的凋亡控制程序缺陷、癌细胞发展出抗药性，导致癌症病人 在临床上化疗后仍然会复发。目前的研究已经发现多种不同类型的癌细胞均可从 凋亡过程中复原，证明癌细胞可能利用某种未知的逃避机制使自己在化疗后继续 存活。因此，对细胞早期凋亡及其复原过程机制的研究将对于今后的抗肿瘤工作 及药物研发方面具有重要意义，于是一种可以方便、非介入的监测细胞生理活性 的手段就显得十分必要。

目前针对细胞凋亡的检测方法主要为介入性技术，可以分为如下几类：

1.使用染料对细胞某一靶点进行染色，通过对荧光进行测定得到相应信息， 如使用罗丹明123染色线粒体，在线粒体膜电位下降时，荧光逐渐减弱；或者使 用碘化丙啶对细胞核染色，凋亡过程中，细胞核被包裹于凋亡小体中，随凋亡的 进程，细胞内细胞核逐渐减少，荧光强度降低。对细胞染色一般使用激光扫描共 聚焦显微镜或者流式细胞仪进行检测。

2.DNA片断化是凋亡晚期的一个重要特征。普通的琼脂糖凝胶电泳可检测DNA 的片断化。将DNA提取出来，进行电泳，凋亡细胞就会产生阶梯状的电泳条带， 间隔大约是180bp。这种方法对于凋亡细胞数量多的实验来说较适用，但对于少 量细胞则灵敏度不够。目前更为常用的DNA片断化检测方法是TUNEL法，但它的 费用也比电泳法高，而且可能会存在坏死细胞或其它细胞的假阳性。

3.细胞凋亡会使细胞质、细胞核和细胞膜发生一系列生物化学和物理上的变 化。在细胞凋亡早期，细胞膨胀变圆，与邻近细胞的联系断绝并且脱离后皱缩。 在细胞质中，内质网肿胀积液形成液泡。在细胞核内，染色质逐渐凝集成新月状， 附在核膜周边，嗜碱性增强。最终细胞核裂解为由核膜包裹的碎片。在细胞膜上， 细胞结点不再相连，细胞膜变得更活跃进而发生内陷。这些变化都将导致细胞裂 解为由细胞膜包裹细胞内容物的凋亡小体。目前可以使用固定液固定细胞，通过 利用电子显微镜观察细胞内部细胞核皱缩，或者外部特征如细胞膜凋亡小体等判 断细胞正在处于的凋亡阶段。

上面所述为目前所普遍流行的检测凋亡技术，但它们仍或多或少存在一些问 题。对于其中众多手段来说，研究对象的不同可能导致研究结果与真实情况严重 偏离。首先的一个问题就是不同研究对象的受体或者蛋白的表达不同。比如 Annexin V实验，不同细胞由于本身细胞膜上磷脂酰丝氨酸表达数量的不同，可能 造成的结果就是，同一种方法应用在高表达的细胞上会得到比较满意的结果，但 是对于那些低表达磷脂酰丝氨酸的细胞在凋亡过程中则可能根本看不到明显的变 化。再比如目前公认在凋亡过程中起重要作用的caspase家族蛋白，在不同种属 不同组织的细胞内部的表达也截然不同，如乳腺癌细胞系MCF-7缺少功能性 caspase-3蛋白，所以当使用DEVD底物来检测caspase-3活性时，凋亡情况可能 会被低估。

另外一个问题就是不同生化事件或活性的时间点往往是不同的，很多蛋白或 受体的表达在某一时间点会迅速达到峰值，然后下降。如果错过这个时间段，将 导致结论严重错误。比如在使用抗Fas单克隆抗体处理Jurkat细胞后，caspase-8 活性在处理后2小时开始迅速增加，3小时就达到峰值，此后活性逐渐下降。但如 果在检测时比较1小时和7小时溶剂对照组和抗Fas单克隆抗体处理组的 caspase-8活性，则会认为信号太弱从而得出该处理方式不会诱导细胞凋亡的结 果，造成结论错误。