[发明专利]土壤元蛋白质组的制备方法

说明书

技术领域：

本发明涉及生物技术领域，具体涉及针对土壤样品进行一系列的处理以获得土壤元蛋白质组。

背景技术：

自然条件下微生物群落作为一个系统的整体发挥着重要的生态学功能，人们主要借助分子生物学手段对群落的基因结构和多样性等进行分析和认识，在解析其内在的功能特点上具有一定的局限性。环境微生物群落表达的总蛋白质(元蛋白质组)可以反映环境微生物群落的功能结构，可以作为功能性的分析环境微生物群落的一个重要手段。利用元蛋白质组更直接的从功能水平上认识微生物群落在环境原位条件下行使的功能和生理特点。对于土壤蛋白质组的研究还刚刚起步，制备土壤蛋白质组的方法目前主要分为两类：一类是仅仅提取土壤中可溶于水相的微生物外泌蛋白；另一类是将土壤中的微生物分离收集后再提取相应微生物的蛋白质。显然这两种方法都只能部分的得到土壤元蛋质组成分，直接抽提土壤元蛋白质组比较困难，究其原因是由于土壤中含有大量的重金属、腐殖酸等杂质，这些物质一般不易去除，而且往往会影响到蛋白质的提取以及下游的分析。因此有必要运用新的技术解决上述问题制备土壤元蛋白质组，方便人们功能性的分析土壤环境微生物群落。

发明内容：

本发明旨在通过系列处理技术，去除土壤中的腐殖酸物质等，提取并获得高质量、高纯度的土壤元蛋白质组。

本发明所述的制备土壤元蛋白质组的方法如下：

(1)样品的前处理：土壤样品与1～2倍体积的0.1～0.3％的无菌焦磷酸钠溶液混匀，室温温育10～30min，间歇摇匀。15000～18000×g离心20～30min，收集沉淀物。

(2)收集的土壤沉淀物与2～3倍体积的0.1～0.2M的氢氧化钠溶液混匀，室温温育30～50min，间歇摇匀。15000～18000×g离心10～30min，收集上清液。

(3)上清液加入2～3倍体积的液体苯酚，室温温育60～90min，间歇摇匀。13000～15000×g离心10～20min，收集下层苯酚相。

(4)下层苯酚相加入等体积的水混匀离心洗涤1次，然后加入5倍体积的乙酸铵甲醇溶液，-20℃沉淀过夜。

(5)蛋白质经过80％丙酮，70％乙醇顺次洗涤后溶于双蒸水。

本发明依据物理化学以及生化原理对土壤样品进行顺次处理，逐步提取并纯化土壤蛋白质组。本发明对土壤杂质成分重金属、腐殖酸等物质去除效果明显，可以直接从土壤样品中提取得到大量的蛋白质，完全满足下游的分析工作需要。并且本发明的使用对象范围广，可以适用于各种土壤样品以及水体沉积物等样品。

具体实施方式：

以下将将结合具体实施例对本发明作进一步的说明，目的在于帮助读者更好的理解本发明的精神实质，但不作为对本发明实施范围的限定。

实施例：

称取5g土壤样品，置于50ml离心管中，加入5ml焦磷酸钠溶液(0.1％)，颠倒数次混匀后，置于室温条件下20min，间隔10min轻柔颠倒混匀。然后在18000×g室温条件下离心20min，收集沉淀物并加入10ml氢氧化钠溶液(0.1M)混匀，室温温育30min，间歇摇匀。16000×g离心20min，收集上清液。此上清液中加入16ml液体苯酚(10g苯酚和1g水的混合物)，室温温育60min，间歇摇匀。14000×g离心10min，收集下层苯酚相。下层苯酚相加入等体积的水(15ml)混匀离心洗涤，14000×g离心10min，保留苯酚相。然后向苯酚相中加入5倍体积的乙酸铵甲醇(0.1M)溶液，-20℃沉淀过夜。沉淀悬浮在10ml预冷的乙酸铵甲醇(0.1M)溶液，-20℃放置15min，0℃条件下16000×g离心10min。沉淀悬浮在2ml 80％的丙酮中，-20℃放置15min，0℃条件下16000×g离心10min。沉淀再次悬浮在2ml 70％乙醇的乙醇中，-20℃放置15min，0℃条件下16000×g离心10min。沉淀晾干后加入50μl水溶解后-20℃存放备用。土壤样品通过焦磷酸钠溶液前处理，再采用碱裂解联合石炭酸抽提土壤样品的蛋白质，进一步采用乙酸铵甲醇溶液纯化提取的蛋白质。测定结果表明获得的土壤蛋白质含有较少的腐殖酸等干扰物，蛋白质的平均得率为18.9μg/g土壤。