[发明专利]myostatin基因第三外显子单碱基突变的快速检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种检测牛肌肉生长抑制 素基因第三外显子单核苷酸多态性(SNP)的快速检测方法。

背景技术

肌肉生长抑制素(myostatin)又称生长分化因子8(growth differentiation factor 8，GDF-8)，是转化生长因子β(transforming growth factor TGF-β)超家族的成员，研究结果表明，其功能为骨 骼肌生长发育的负调控因子，因此GDF-8的突变是造成牛双肌的原 因。比利时蓝牛的双肌个体在外显子3缺失11bp(937-947)，造成 移码突变，导致从缺失后的14个密码子开始停止翻译，结果C-端仅 7个氨基酸被翻译，之后的102个氨基酸(274-375)全部丢失，故 翻译出的蛋白不能正常发挥其生物学功能。在皮埃蒙特牛中，位于 外显子3的938位G→A突变，导致所编码的氨基酸由保守半胱氨 酸变成酪氨酸，结果肌肉生长抑制素的功能全部或几乎全部丧失(孟 和等，2004；史明艳等，2005)；由于突变导致的对肌肉生长基因 抑制的消失使得具有该突变个体的肌肉生长异常发达，肉牛育种中 该基因多态性的检测就显得尤为重要。

目前针对myostatin基因第三外显子多态性除了直接测序外，已 建立了3种检测方法：

1)PCR-SSCP法

该方法是PCR技术与SSCP技术的结合，其原理是根据单链 DNA在非变性条件下具有特定的构象，而当DNA序列甚至单个碱 基改变时，这种特定构象就被改变，在进行非变性聚丙烯酰胺凝胶 电泳时，长度相等构象不同的单链DNA表现为不同的电泳迁移率， 从而间接地对基因多态性进行检测分析(薛燕等，2005；王威等， 2006)。该方法无需知道待检测DNA片段序列上多态性的有无，只 要对目标序列进行PCR扩增，然后PCR产物经变性处理变为单链 DNA，再经SSCP分析即可判定基因的多态性。能检测出DNA片段 长度相同碱基序列不同的所有突变位点；但是检测结果重复性差、 存在假阳性和假阴性、不能直接鉴定目标位点的碱基多态类型，必 须借助于同位素或银染等显色技术进行检测分析，耗时长、操作繁 琐、成本较高(Sheffield V C et al，1993；薛燕等，2005)。

2)聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP)方法

该技术是根据限制性内切酶可以特异性地识别和切割DNA特 异位点(4-6bp)的特点，利用DNA序列上碱基的突变即替换或插 入、缺失可以产生或消除一个特定酶切位点，从而使酶切产物发生 片段大小的改变。所以，目标位点进行PCR扩增后，会由于SNP 位点的存在，在目标产物中产生或消除了某个限制性内切酶位点， 通过选用特定的限制性内切酶对PCR扩增产物进行酶切和电泳检 测，而实现目标位点基因型多态性的鉴定分析。

PCR-RFLP法适用于一些小样本已知突变位点的检测，具有操 作简便、特异性高、重复性好等优点，但是酶切位点的选择难度较 大、酶切位点的有无和内切酶的价格也是实践中应该重点考虑的问 题(杨卫华等，2002；王威等，2006)。

3)创造酶切位点方法(Created Restriction Site PCR，CRS-PCR)

根据单碱基突变位点的碱基替代情况设计PCR引物，将突变位 点附近的碱基(如前一位碱基)设计为引物3′端，在引物序列中人 为引入错配碱基，使得引物3′端和单碱基突变的一种突变型在PCR 扩增后形成一个酶切位点，可以被相应的内切酶切割开来，而另外 一个基因型却不能被所选用的内切酶切割开，这样PCR扩增产物经 酶切电泳后即可进行基因多态性的分析鉴定。

研究表明CRS-PCR法是检测已知突变位点SNP的有效方法， 灵活性较大，可以进行基因型的鉴定，拓宽了RFLP方法的适用范 围；但是错配引物选择余地较小，难度较大，同时错配碱基的选择 要考虑形成酶切位点后对应的限制性内切酶是否容易购买和成本问 题，酶切后短片段较小，长片段与非酶切产物的差异较小，基因型 区分较难，操作较繁琐，耗时较长(赵春江等，2003；张忠彬等， 2004；Kwok S et al，1990)。