[发明专利]海洋细菌新型低温碱性蛋白酶MP晶体

说明书

技术领域

本发明涉及海洋微生物酶领域，特别是涉及海洋细菌新型低温碱性蛋白酶MP晶 体。

背景技术

酶制剂产业经历了半个多世纪的起步和迅速发展之后，现已形成一个富有活力 的高技术产业，在洗涤、皮革、食品、饲料、制药和纺织等工业领域得到广泛应用。 蛋白酶作为一种酶制剂，其市场占有率已经超过了40％。

碱性蛋白酶的应用起源于20世纪60年代，来自地衣芽孢杆菌的Carlsberg丝氨酸 蛋白酶首次作为洗涤添加剂被推向市场。由于其不仅能够水解去除衣物上的奶渍、 汗渍、血渍等污物，而且与洗涤剂的相容性较好，因此受到了世界范围的酶制剂市 场的关注。

随着绿色、环保、节能理念的深入，无磷和低温洗涤已成为一个趋势，它改变 了长久以来的洗涤习惯。为了获得更好的洗涤效果，人们不得不提高洗涤液的碱度， 同时在洗涤液中添加氧化剂增强洗涤效果，但已有的天然碱性蛋白酶不能很好的适 应现有的应用环境。因此，许多国家展开了应用蛋白质工程对现有的碱性蛋白酶进 行人工改造的研究，同时从自然界中寻找新的碱性抗氧化蛋白酶。

传统上从自然界中筛选得到的抗氧化蛋白酶OSP(Oxidatilvely Stable Protease)多 数来源于陆地的芽孢杆菌属菌株，属于丝氨酸蛋白酶类。

海洋环境不同于陆地，造就的生物具有独特的代谢途径和遗传背景，代谢过程中 的酶类在性质、功能上与陆地生物酶有很多不同。欧、美及日本等国每年投入数亿 美元的资金，用于海洋酶领域的研究与开发。

在海底发现了许多极端微生物。这些微生物生活在接近冰点的环境中，它们的 酶演化出适应低温的能力。例如来自黄海的细菌YS-80的新型低温碱性蛋白酶MP就具 有独特性能的低温蛋白酶，为目前我国紧缺的蛋白酶增添新来源，深入进一步研究 开发是我国酶制剂工业急需迫切任务。

发明内容

本发明的目的在于采用现代科学技术，开发提供来自黄海的细菌YS-80的海洋细 菌新型低温碱性蛋白酶MP晶体。

本发明提供的海洋细菌新型低温碱性蛋白酶MP晶体(简称蛋白酶MP(晶体))， 其特征在于来自黄海的海洋细菌YS-80的新型低温碱性蛋白酶MP晶体，既具有蛋白 酶MP结构特征性能，又具有晶体特征参数，蛋白酶MP是胞外酶，分子量49320Da， pI＝8.5，最适催化温度30℃，最适pH9.5；EDTA抑制酶活性。低温碱性蛋白酶MP含 463个氨基酸。

蛋白酶MP是一种整体结构较紧凑的低温蛋白酶。和中温同源蛋白相比，低温酶 通常柔性更好，氢键更弱，表面环区更松散，蛋白酶MP整体结构见图1，蛋白酶MP 结构中含有一个锌离子、两个氯离子和八个钙离子。蛋白酶MP有两个结构域，N端 结构域是蛋白水解结构域，含有活性位点(包括锌离子)，从20至247残基。C端结构域 是从248至463残基，包括一个平行β卷结构和七个结合的钙离子，主要和蛋白稳定 性相关。蛋白酶MP和PAP有42个氨基酸的差别，主要是在C端结构域。

结合锌离子的活性位点

在蛋白酶MP中含有保守的锌结合金属蛋白酶(metzincin)的基序 HEXXHXXGXXHZ(蛋白酶MP的169-180残基)，其中His169，His173，His179和 Tyr209是锌离子的配体。Tyr209和锌离子距离为

钙离子

蛋白酶MP含有8个钙离子。通过蛋白酶MP的结构分析，蛋白酶MP的8个钙 离子中的5个(Ca 700，Ca 701，Ca 702，Ca 705 and Ca 706)结合在平行β卷结构的核 心，在这里其它离子很难进入并占据配基的位置。蛋白酶MP中的Ca 704和Ca 707 这两个钙离子的所有配基都和氨基酸残基结合，而Ca 703却更靠近溶剂。

环区

蛋白酶MP的整体结构较紧凑，主要表现为蛋白酶MP中的几个环的位置向蛋白 内部移动。这些环包括残基21-29，67-70，220-226，405-421，428-432和440-447。

蛋白酶MP晶体见图2，晶体结构数据列于表1。

表1  蛋白酶MP的晶体结构数据