[发明专利]一种组织工程微囊化肝细胞及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及动物细胞组织工程产品，更具体的说，涉及一种组织工程微囊化肝细胞及其制备方法和应用。

背景技术

肝功能衰竭是临床难治性疾病，死亡率很高。目前，在临床上治疗肝衰竭可行的方法主要有以下两种：肝脏移植与肝细胞移植。这些治疗方式虽然能明显改善患者症状，但也存在很多问题：如肝器官移植受到供体器官匮乏，高额费用和长期需要使用免疫抑制剂的限制。另外一种行之有效的方法是肝细胞的移植，如果在肝衰竭患者体内成功植入一定数量的肝细胞，其肝脏的功能将会得到提高，并明显促进肝脏的再生。但是，在移植后机体会产生强烈的免疫排斥反应，从而导致移植最终失败。尽管使用免疫抑制剂是一种常见的解决方法，但是它的毒副作用会使重症肝病患者产生相关的并发症。因此，微囊化细胞疗法为无免疫抑制剂的情况下的细胞移植开辟了广阔的前景。

微囊技术是指用半透膜包被生物活性物质以形成微囊的技术，形成的微囊可以阻遏免疫细胞以及大分子抗体通过半透膜，同时允许氧气、营养物质和一些具有生物活性的小分子物质自由出入，因此，该技术是目前细胞治疗、组织和器官替代治疗的主要方法之一。自从1964年，Chang引用微囊技术进行细胞移植，并首次提出“人工细胞”的概念以来，微囊技术取得了迅速发展。随后的二十年间，人们不断尝试用这种方法包埋胰岛细胞来控制糖尿病小动物模型的高血糖。1986年，O’Shea等人在已有基础上对成囊物质进行了革新，制成了海藻酸钠-多聚赖氨酸-海藻酸钠(APA)微囊。近年来随着生物材料、细胞生物学、工程科学的发展，为微囊化人工细胞研究提供了强大动力，并先后在基因工程细胞、嗜铬细胞、干细胞以及胰岛微囊化研究中取得可喜进展。

微囊具有良好的生物相容性，合适的半透性、较强的机械稳定性和较低的免疫原性。微囊膜可提供细胞附着的基质，使肝细胞相互接触，并形成一种三维结构。此外，微囊膜的多孔性结构允许白蛋白、营养物质及代谢物的自由弥散，肝细胞可以跨膜获得养分，但又能阻止高分子量物质如免疫球蛋白和补体通过，从而避免免疫细胞及免疫分子对囊内细胞的损伤，起到免疫屏障作用。2000年，有文献报道肝细胞和干细胞进行微囊共包裹成功用于移植治疗后，微囊化肝细胞在急性肝衰竭治疗中的作用受到研究人员的广泛青睐，研究进展迅速。

血管内皮细胞是形成血管网络的主要功能细胞，在肝小叶中，内皮细胞和肝细胞互相连接排列形成多层三维组织结构，通过细胞连接、细胞外基质调控肝细胞的生长、分化、凋亡及功能。有研究证明，内皮细胞与肝细胞共培养能够维持肝细胞的活性及功能。AKIRA ITO等(Ito A，Takizawa Y，Honda H，HataK，Kagami H，Ueda M，Kobayashi T.Tissue engineering using magnetitenanoparticles and magnetic force：heterotypic layers of cocultured hepatocytes andendothelial cells，Tissue Eng.，2004，10(5-6)：833-40)将磁力标记了的内皮细胞与肝细胞共培养，发现这种共培养的结构与同型单纯肝细胞相比显著提高了肝细胞的白蛋白分泌。Takayama等(Takayama G，Taniguchi A，Okano T.Identificationof differentially expressed genes in hepatocyte/endothelial cell co-culture system，Tissue Eng.，2007，13(1)：159-66)证实了将大鼠肝细胞与人脐带静脉内皮细胞双层共培养后，与细胞连接相关的基因和肝特异性标志基因的表达都显著提高，这表明即使不同种的细胞之间通过细胞外基质和细胞因子信号的连接，也会发生相互间的作用，因此共培养体系可以作为一种分析细胞间作用的有用的模型。但是上述模型都是体外模型，一旦移植到体内就会引起机体的免疫排斥反应，本发明中的微囊是一种生物相容性高，具有较低免疫原性的半透膜，在植入机体体内后可以保护微囊内部的细胞免受机体免疫系统的排斥，以达到更好的发挥细胞功能的目的。

目前国内外尚未见微囊化肝细胞和血管内皮细胞治疗肝衰竭的相关报道。

发明内容

本发明的目的是要提供一种组织工程微囊化肝细胞及其制备方法。

一种组织工程微囊化肝细胞的制备方法，按照如下的操作步骤进行：