[发明专利]蚕豆的PCR鉴定引物及鉴定方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物检测技术，具体地说涉及对蚕豆生物资源进行 检测用引物及PCR检测方法。

背景技术

蚕豆属豆科野豌豆属植物。蚕豆中含有调节大脑和神经组织的 重要成分钙、锌、锰、磷脂等，并含有丰富的胆石碱，有增强记忆 力的健脑作用。蚕豆中的钙，有利于骨骼对钙的吸收与钙化，能促 进人体骨骼的生长发育。蚕豆中的蛋白质含量丰富，且不含胆固醇， 可以提高食品营养价值，预防心血管疾病。蚕豆中的维生素C可以 延缓动脉硬化，蚕豆皮中的膳食纤维有降低胆固醇、促进肠蠕动的 作用。此外，现代人还认为蚕豆也是抗癌食品之一，对预防肠癌有 作用。蚕豆在我国各地都有种植，是重要的粮、菜、肥兼用型作物。 主要用于稻、麦田套种和中耕作物行间间种，摘青嫩荚果做蔬菜或 收子食用，茎杆翻压作绿肥。我国是一个蚕豆属植物种质资源十分 丰富的国家，有许多优良品种，主要的优良品种有四川青胡豆、南 翔白皮、兴宁、莆田等。这些品种已成为我国许多地区生产上大量 栽培的品种，大大地促进了我国蚕豆相关产业的发展。为防止我国 蚕豆种质资源的流失，对我国的社会生产力造成难以估量的损失， 应该加大对我国蚕豆资源的保护与研究工作。

现代生物技术的出现，使基因资源更多的是以非活体的遗传物 质形式携带出境，使得口岸查验更加困难，因而研究及建立有效的 遗传资源出境检验鉴定方法以及相关的能力建设就显得极为必要。

目前国内外对于蚕豆的识别仅限于形态上，未见分子检测方法 的研究。

本发明应用PCR方法对蚕豆的分子检测方法进行研究，通过 trnL序列设计特异引物，建立了对蚕豆稳定、高效的鉴定方法、成 本低，可根据对扩增产物的普通琼脂糖电泳判定是否有蚕豆核酸存 在。

发明内容

本发明目的在于提供用于蚕豆PCR检测的引物及方法。

本发明通过分析蚕豆与其近缘种等禾本科植物叶绿体trnL基 因序列的基础上，设计特异引物，能够快速、准确地对蚕豆进行定 性检测。

本发明提供的检测引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1和2所示。

以样品总DNA为模板，上述的引物进行PCR扩增，根据PCR 扩增产物判定样品是否为蚕豆。即检测PCR产物中是否存在198bp 的特异性扩增。具体地说，可以利用琼脂糖凝胶电泳进行检测，根 据是否存在198bp的特异性条带，来判断样品是否为阳性。

PCR25μL反应体系：样品DNA 1μL(10-50ng)，10×PCR buffer (Mg²⁺ free)2.5μL，25mM MgCL₂ 2μL，10mM dNTPs 2μL，10μM Primers 2μL，5U/μL Taq DNA polymerase 0.1μL，ddH₂O 15.4μL。

反应条件：预变性94℃3min，再经94℃变性30sec，66℃退 火30sec，72℃延伸30sec，30循环，最后72℃延伸5min。

可以将本发明引物以及相关试剂组装成试剂盒，以方便使用。

本发明建立了适合口岸应用的简便的检测方法，即直接从进、 出境的禾本科类材料上检测蚕豆，操作快捷、结果准确，避免了用 传统的形态分类学和细胞学方法所产生的耗费时间和易疏漏的缺 陷，顺应了当今口岸检测工作的特点。

附图说明

图1是PCR对蚕豆特异性检测实验；

图中，M为DNA marker DL 2,000；1小扁豆；2蚕豆；3菜豆； 4豌豆；5自贡冬豆；6吉林小粒；7晋豆21；8冀豆12；9野生 大豆236；10肯农18；11日本晴；12玉米；13中国春；CK水 对照。

具体实施方式

下面实施例用于对本发明的进一步说明，但不用来限制本发明 的范围。

实施例1引物的设计

根据蚕豆trnL序列，利用软件和Primer 3设计引物，经过多轮 筛选，意外发现以下引物的特异性显著优于其它引物，该引物序列为：

正向：5’-TTAAATGGGCAATCCTGAGC-3’

反向：5’-CAATTGTGATCGAATCAAAACTAAA-3’。

实施例2总DNA的提取